Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Embryonen innerhalb einer Bildgebungssitzung. Während die Probenvorbereitung für die Mehrpunkterfassung mit einem Hochgehaltsanalysator angepasst ist, können Proben, die mit diesem Protokoll erstellt wurden, auf jedem invertierten Mikroskop abgebildet werden, das in der Lage ist, mehrere Punkte zu akzieren. Um zu beginnen, organisieren Sie zwei Reihen von 15 bis 20 Embryonen auf einem sauberen Abschnitt der großen Platte mit einem Eierpflücker-Werkzeug.
Richten Sie die Embryonen auf ihrer ventralen Seite in der gleichen Ausrichtung in Bezug auf vordere und hintere Enden aus. Einen Abstandsabstand auf einen Deckelschlupf und Streifen 10 Mikroliter Heptan leimen den freiliegenden Deckelglaseinschub. Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein Rechteck um die beiden Reihen von Embryonen zu schneiden.
Schneiden Sie ein zweites Rechteck neben dem ersten und entfernen Sie das zweite Rechteck mit einer geraden Randseite eines Edelstahlspachtels. Schieben Sie vorsichtig die gerade Kante des Spachtels unter das erste Rechteck und entfernen Sie ihn. Dann legen Sie den Ausschnitt mit Embryonen auf der Außenseite einer 3,5-Zentimeter-Schale.
Senken Sie unter einem Stereomikroskop einen vorbereiteten Deckel über die Embryonen und drücken Sie vorsichtig die beiden Embryonenreihen auf den Kleber. Wenn keine Mikroinjektion durchführen, füllen Sie den Silikon-Abstandsraum auf halbem Weg nach oben mit einem 1:1-Halocarbonöl 700 bis Halocarbonöl 27. Verfeinern Sie die unteren Ränder eines Vier-Schiebe-Plattenadapters mit doppelseitigem Klebeband.
Dadurch wird verhindert, dass sich das Dia während der Bildgebung bewegt. Stellen Sie sicher, dass Sie das Band nicht in den Pfad der Objektivlinse legen. Montieren Sie den Deckelschlupf am Vier-Schiebe-Plattenadapter.
Wenn die Embryonen mikroinjiziert werden, legen Sie den Deckelrutsch mit Embryonen über einen Schlitten, um zu verhindern, dass der Boden des Deckels während der Austrocknung und Mikroinjektion schmutzig wird. Die Embryonen fünf bis zehn Minuten lang verachten und dann sofort mit einem Halocarbonöl 700 bis Halocarbonöl 27 bedecken und den Silikonabstands auf halbem Weg nach oben füllen. Laden Sie zwei oder drei Mikroinjektionsnadeln mit etwa zwei Mikroliter Ninjectant mit einer verlängerten Ladespitze.
Montieren Sie eine Nadel auf den Mikroinjektor und drücken Sie den Kolben auf halbem Weg zur Spitze, wodurch der Luftdruck innerhalb der Glaskapillare erhöht wird. Senken Sie die Glasnadel auf eine Glasrutsche und schneiden Sie die Spitze der Nadel mit einem neuen Rasiermesser mit der Nummer neun, wobei Sie in einem 45-Grad-Winkel schneiden, um eine scharfe offene Spitze zu erzeugen. Der Injektor sollte bis zum Boden der Spitze fließen, ohne aus der Nadel zu fließen.
Fügen Sie vorsichtig 20 Mikroliter Halocarbonöl über die Spitze der Nadel und schneiden Sie es in einem 45-Grad-Winkel geöffnet. Der Injektor sollte schnell zu fließen beginnen, also denken Sie daran, den Druck durch Einziehen des Kolbens einzustellen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren.
Heben Sie dann die Nadel an und entfernen Sie die Glasrutsche unter ihr. Stellen Sie die Embryonen auf die Stereomikroskop-Stufe unter die Mikroinjektionsnadel und konzentrieren Sie sich bei der 50-fachen Vergrößerung auf sie. Senken Sie die Nadel, bis sie in die gleiche Fokusebene wie die Embryonen kommt.
Bewegen Sie die Folie mit einer Hand und bedienen Sie den Mikroinjektor mit der anderen, injizieren Sie eine Reihe von Embryonen. Heben Sie die Nadel an und drehen Sie den Schlitten um 180 Grad, um die zweite Reihe von Embryonen der Mikroinjektionsnadel auszusetzen. Senken Sie die Nadel und injizieren Sie die zweite Reihe von Embryonen.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli bei der endoplasmatischen Retikulumreorganisation während der Mitose im Drosophila-Embryo zu untersuchen. Die Auswirkungen mehrerer mikroinjizierter Arzneimittelbehandlungen auf die ER-Reorganisation wurden quantitativ verglichen. Colchicin, das eine neue Mikrotubulipolymerisation verhindert, wurde gefunden, um die Lokalisation des ER auf Spindelpole während der Mitose drastisch zu reduzieren.
Für 32 Embryonen wurden Zeitraffer-Bildgebungsdaten erfasst. Mittelwert- und Max-Intensitätsmessungen wurden aus 12. 800 Interessensgebieten mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript analysiert. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, nicht zu lange auf einen Schritt zu nehmen, sonst riskieren Sie, Ihre Entwicklungsphase zu verpassen, die Sie abbilden möchten.
Üben Sie dieses Protokoll Schritt für Schritt, bevor Sie Experimente versuchen. Unsere Methode der Probenvorbereitung ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Embryonen während eines Experiments und erzeugt so genügend experimentelle Replikationen für die quantitative Analyse. Dieses Protokoll kann den Übergang der Entwicklungsembryologie von qualitativen zu quantitativen bildgebenden Experimenten erleichtern.
Die Möglichkeit, mehrere Embryonen innerhalb einer Bildgebungssitzung abzubilden, eliminiert auch experimentelles Rauschen zwischen Replikationen.
