Este protocolo permite uma aquisição simultânea de múltiplos embriões dentro de uma sessão de imagem. Enquanto a preparação da amostra é adaptada para aquisição de vários pontos usando um analisador de alto teor, as amostras preparadas usando este protocolo podem ser imagens em qualquer microscópio invertido capaz de aquisição de vários pontos. Para começar, organize duas fileiras de 15 a 20 embriões em uma seção limpa de grande prato usando uma ferramenta de colhedor de ovos.
Alinhe os embriões em seu lado ventral na mesma orientação em relação às extremidades anterior e posterior. Adere a um espaçador em uma mancha de cobertura e estria 10 microliters de cola heptane pelo inset de vidro de deslizamento de tampa exposto. Enquanto a cola seca, use uma lâmina de barbear para cortar um retângulo ao redor das duas fileiras de embriões.
Corte um segundo retângulo ao lado do primeiro e remova o segundo retângulo com um lado de borda reta de uma espátula de aço inoxidável. Deslize cuidadosamente a borda reta da espátula sob o primeiro retângulo e remova-a cuidadosamente. Em seguida, coloque o recorte com embriões no lado externo de um prato de 3,5 centímetros.
Sob um microscópio estéreo, abaixe uma mancha de cobertura preparada sobre os embriões e pressione suavemente as duas fileiras de embriões sobre a cola. Se não estiver realizando microinjeção, preencha o espaçador de silicone a meio caminho do topo com óleo de halocarboneto de um para um 700 a óleo de halocarboneto 27. Fore as bordas inferiores de um adaptador de placa de quatro slides com fita dupla face.
Isso evitará que o slide se mova durante a imagem. Certifique-se de não colocar a fita no caminho da lente objetiva. Monte a tampa no adaptador de placa de quatro slides.
Se microinjetar os embriões, coloque o deslizamento com embriões sobre um slide para evitar que o fundo da tampa fique sujo durante a dessecação e microinjeção. Dessobsculir os embriões por cinco a 10 minutos, depois cubra-os imediatamente com óleo de halocarbono de um para um 700 a óleo de halocarboneto 27, enchendo o espaçador de silicone a meio caminho do topo. Carregue duas ou três agulhas de microinjeção com aproximadamente dois microliters de injetor usando uma ponta de carregamento estendida.
Coloque uma agulha no microinjetor e deprima o êmbolo no meio da ponta, aumentando a pressão de ar dentro do capilar de vidro. Abaixe a agulha de vidro em uma lâmina de vidro e corte a ponta da agulha com uma nova lâmina número nove, cortando em um ângulo de 45 graus para produzir uma ponta aberta afiada. O injetor deve fluir até o fundo da ponta sem fluir para fora da agulha.
Adicione cuidadosamente 20 microliters de óleo de halocarboneto sobre a ponta da agulha e corte-o lentamente em um ângulo de 45 graus. O injetor deve começar a fluir rapidamente, então lembre-se de ajustar a pressão retraindo o êmbolo. Use o micromanipulador para posicionar a agulha no centro do campo de visão.
Em seguida, levante a agulha e remova o deslizamento de vidro debaixo dela. Coloque os embriões no estágio do microscópio estéreo, sob a agulha de microinjeção e concentre-se neles em 50 vezes a ampliação. Abaixe a agulha até que ela entre no mesmo plano de foco que os embriões.
Movendo o slide com uma mão e operando o microinjetor com a outra, injete uma linha de embriões. Levante a agulha e gire o slide 180 graus para expor a segunda fileira de embriões à agulha de microinjeção. Abaixe a agulha e injete a segunda fileira de embriões.
Este protocolo foi utilizado para examinar o papel dos microtúbulos na reorganização do ritúlume endoplasmático durante a mitose no embrião de Drosophila. Os efeitos de vários tratamentos medicamentosos microinjetados na reorganização do ER foram quantitativamente comparados. A colchicina, que previne a nova polimerização de microtúbulos, foi encontrada para reduzir drasticamente a localização do ER para polos de fuso durante a mitose.
Dados de imagem de lapso de tempo foram adquiridos para 32 embriões. Medições médias e de intensidade máxima foram analisadas a partir de 12.800 regiões de interesse usando um script MATLAB personalizado. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, lembre-se de não demorar muito em nenhum passo, caso contrário, você corre o risco de perder o estágio de desenvolvimento que você quer imaginar.
Pratique este protocolo passo a passo antes de tentar qualquer experimento. Nosso método de preparação amostral facilita a aquisição simultânea de múltiplos embriões durante um experimento, gerando assim réplicas experimentais suficientes para análise quantitativa. Este protocolo pode ajudar a transição de embriologia do desenvolvimento de experimentos qualitativos para quantitativos de imagem.
A capacidade de imagem de múltiplos embriões dentro de uma sessão de imagem também elimina o ruído experimental entre as réplicas.
