Этот протокол позволяет одновременно приобретение нескольких эмбрионов в течение одного сеанса визуализации. В то время как подготовка образца адаптирована для многоточных приобретений с помощью анализатора высокого содержания, образцы, подготовленные с помощью этого протокола, могут быть изображены на любом перевернутом микроскопе, способном к многотой сделке. Для начала организуйте два ряда от 15 до 20 эмбрионов на чистом участке большой тарелки с помощью инструмента сборщика яйцеклеток.
Выравнивание эмбрионов на их брюшной стороне в той же ориентации по отношению к передним и задним концам. Придерживайтесь спейсера на крышку и полоса 10 микролитров гептана клей вниз подвергаются крышки стекла вставки. Пока клей высыхает, используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать прямоугольник вокруг двух рядов эмбрионов.
Вырежьте второй прямоугольник рядом с первым и удалите второй прямоугольник с прямой стороны края шпателя из нержавеющей стали. Аккуратно сдвиньте прямой край шпателя под первый прямоугольник и удалите его. Затем поместите вырез с эмбрионами на внешней стороне 3,5 сантиметра блюдо.
Под стерео микроскопом опустите подготовленный чехлы над эмбрионами и аккуратно прижимите два ряда эмбрионов к клею. Если не выполняет микроинъекции, заполнить силиконовый спейсер на полпути к вершине с один-к-одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27. Линия нижних краев четырехскользячой пластины адаптер с двусторонним лентой.
Это предотвратит перемещение слайда во время визуализации. Убедитесь, что не по месту ленты на пути объективного объектива. Намонтировать крышку на адаптере из четырех слайдов.
Если микроинъекции эмбрионов, поместите крышку с эмбрионами на слайд, чтобы предотвратить дно крышки от пачкаться во время высыхания и микроинъекции. Высасывайте эмбрионы в течение пяти-десяти минут, затем немедленно накройте их одним к одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27, заполняя силиконовый спейсер на полпути к вершине. Загрузите две или три микроинъекции иглы с примерно двумя микролитров инъекционных с помощью расширенной нагрузки наконечник.
Наведать иглу на микроинжектор и угнетать поршень на полпути к кончику, увеличивая давление воздуха внутри стеклянной капиллярной. Опустите стеклянную иглу на стеклянную горку и вырежьте кончик иглы новой бритвой номер девять, разрезая под углом 45 градусов для получения резкого открытого наконечника. Инжектор должен стекать вниз к нижней части кончика, не вытекая из иглы.
Аккуратно добавьте 20 микролитров галоуглеродного масла над кончиком иглы и перережьте его, открыв его под углом 45 градусов. Инъекционные должны начать течь быстро, так что не забудьте настроить давление, убирая поршень. Используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу в центре поля зрения.
Затем поднимите иглу и удалите стеклянную горку из-под нее. Поместите эмбрионы на стадии стерео микроскопа, под микроинъекционные иглы и сосредоточиться на них в 50 раз больше. Опустите иглу, пока она не попадает в ту же плоскость фокусировки, что и эмбрионы.
Перемещая слайд одной рукой и оперив микроинжектором с другой, вводите один ряд эмбрионов. Поднимите иглу и поверните слайд на 180 градусов, чтобы подвергнуть второй ряд эмбрионов микроинъекции иглы. Опустите иглу и ввись второй ряд эмбрионов.
Этот протокол был использован для изучения роли микротрубочек в эндоплазмической реорганизации ретикулум во время митоза в эмбрионе Дрозофилы. Влияние нескольких микроинъектных лекарственных препаратов на реорганизацию ER было количественно сопоставлено. Колхицин, который предотвращает новую полимеризацию микротрубочек, был найден, чтобы резко уменьшить локализацию ER шпиндель полюсов во время митоза.
Данные визуализации промежуток времени были получены для 32 эмбрионов. Измерения среднего и максимальной интенсивности были проанализированы из 12 800 областей интересов с помощью пользовательского сценария MATLAB. При попытке этого протокола в первый раз, не забудьте не занять слишком много времени на какой-либо один шаг, в противном случае вы рискуете пропустить этап развития, что вы хотите, чтобы изображение.
Практика этого протокола шаг за шагом, прежде чем пытаться каких-либо экспериментов. Наш метод подготовки образцов облегчает одновременное приобретение нескольких эмбрионов в ходе одного эксперимента, создавая тем самым достаточно экспериментальных репликаций для количественного анализа. Этот протокол может помочь развитию эмбриологии перехода от качественных к количественным экспериментам визуализации.
Возможность изображения нескольких эмбрионов в течение одного сеанса изображения также устраняет экспериментальный шум между репликациями.
