Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Research Fellowship an I. Davis unterstützt.

1. Drosophila Vorbereitung vor für die Dissektion (nach E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Entsorgen Sie die Erwachsenen von einer spärlich gesät Flasche und übertragen Sie die Flasche bis 25 ° C im Vorfeld des Experiments. Sobald neue Erwachsenen begonnen haben, zu entstehen, zwei Tage warten. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit Fliege ca. 10ml von fester Nahrung und fügen 0,5-0,7 Gramm Trockenhefe (siehe Tabelle) auf einem 45 Grad Winkel. Bedecken Sie nicht die ganze Oberfläche der Fliege Essen mit Hefe. </li><li> Fügen Sie einige Tropfen von Wasser auf die Hefe, die ausreicht, um Hydrat (Abbildung 1A). Stellen Sie die Durchstechflasche bei 45 Grad und lassen Sie ca. 3 Minuten für die Hefe, um das Wasser aufzusaugen (Abbildung 1B). </li></ol> Hinweis: Alternativ Vormischung eine Hefe in einem separaten Behälter Paste zermahlen und die Paste in das Fläschchen mit einem Spatel. <ol start="4"><li> Betäuben die Fliegen in der Ampulle durch Injizieren von CO 2-Gas. Wenn sie aufhören zu bewegen, kippen die unbewussten Fliegen auf den CO 2 </sub&gt; Fly-Pad für die Sortierung (Abbildung 1C). </li><li> Isolieren 10-15 Frauen und 5 Männer des gewünschten Genotyps unter einem Binokular mit einer feinen Spitze Pinsel (Abbildung 1D). Männer sind offensichtlich durch die Anwesenheit von claspers, eine dunkle hervorstehenden Struktur, an ihren hinteren. </li><li> Fügen Sie ausgewählt fliegt in die Hefekuchen mit Fläschchen (1E). Platz bei 25 ° C für 24-60 Stunden. Inkubieren Sie für kürzere Zeiträume für eine größere Prozent der jungen bis mittleren Stadium Ei Kammern und längere Zeiträume für Spätstadium Eikammern. </li></ol> 2. Drosophila Ovar Dissektion <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen auf einem Halocarbonöl Nr. 1.5, 22 x 50 mm Deckglas (Abbildung 2A). Stellen Sie die vorbereitete Deckglas der Seite, wo es nicht im Weg sein. </li><li> Betäuben die Fliegen in der Hefekuchen mit abscheulichen durch Injektion von CO 2-Gas und Spitze auf eine CO 2-Pad. </li><li> Scharfe feine Nase Zange zu greifen eine individuelle gemästet am Vorderrand des Bauches weiblich (nicht zwischen the Abdomen und Thorax) (2B-C). </li><li> Halten Sie das Weibchen mit der Zange und sehen unter einem Binokular, etwa 2-3 cm oberhalb der vorbereitete Deckglas. </li><li> Noch Halten auf der vorderen, mit einem zweiten Satz von Zangen, um das Gewebe am äußersten hinteren Ende des weiblichen (2D) zu entfernen. Hinweis: Darmgewebe wird in der Regel ziehen Sie mit dem hinteren Ende. Wischen Sie die entnommene Gewebe aus der Zange. </li><li> Während Sie noch die der weiblichen an der vorderen, verwenden Sie die Zange abgewischt, um sanft drücken oder massieren den Bauch, arbeitet vom vorderen zum hinteren. Massieren das Abdomen in der gleichen Weise wie das Entfernen Zahnpasta aus dem Ende einer Röhre. </li><li> Zwei große opake Strukturen aus dem Bauch und Stick auf dem Ende der Zange (2E-F) geschoben werden kann. Dies sind die gepaarten Eierstöcke. </li><li> Tippen Sie auf die Eierstöcke auf die Halocarbonöl auf der Folie unten. </li><li> Wiederholen Sie die Dissektion 1-2 Mal um insgesamt 6.4 Eierstöcke im Öl auf dem Deckglas geben (Figure 2G). </li></ol> 3. Isolating Ovariolen Hinweis: Jeder Eierstock enthält ca. 16 bis Ovariolen mit 6 bis 10 Eikammern der verschiedenen Stufen, wie Perlen auf einer Schnur 10 angeordnet hat. Hinweis: Vor der Isolierung der Ovariolen, passen Sie die Lichtquelle auf der Seziermikroskop so dass das Licht angestrahlt in einem flachen Winkel auf die Probe. Man erhält Gegensatz zu der Probe und erlaubt die Visualisierung der jungen Stadium Eikammern. <ol><li> In der Öl-, trennen Sie die beiden Eierstöcke durch Entfernen des Bindegewebes am hinteren Ende (alte Stufen) mit geschlossener Zange (Abbildung 3A). </li><li> Orient eine individuelle Eierstock mit der ältesten Bühnen zur linken und jüngste Stufe nach rechts. Die junge Bühne Eikammern im Eierstock sind transparent und bilden die mehr spitze Ende des Eierstocks. </li><li> Mit einer Pinzette in der dominanten Hand, sanft fassen Sie den hinteren eines Eierstocks, vorzugsweise durch den Überresten the Bindegewebe. Halten Sie den Eierstock an Ort und Stelle mit der Zange, verwenden Sie ein Sezieren Sonde (oder Wolfram-Nadel), um herauszuarbeiten, individuelle Ovariolen (3B-D). </li></ol> Hinweis: Einzelne Ovariolen wird zwischen den jungen Stadien (Germarium bis 10-Stadium) zu brechen, wie die älteren Stadien zu groß, um aus der vollständigen Eierstock getrennt werden sollen. Hinweis: Punktieren einer späten Phase Eizelle mit dem Sezieren Sonde wird im Zytoplasma in das auslaufende Öl führen und das Herauslösen einzelner Ovariolen sehr anspruchsvoll. Wenn ein Spätstadium Eizelle punktiert wird, zu einem frischen Eierstock bewegen. <ol start="4"><li> Sobald die Ovariole ist frei von dem Eierstock, verwenden Sie die Sonde sezieren, um es im Zentrum der Öltropfen und Orient in der gewünschten Orientierung für das Experiment ziehen. Hinweis: Ovariolen in Öl absetzen und sich an das Glas. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang (3,3-3,4), bis es 15 bis 25 einzelnen Ovariolen sind. Hinweis: Dies kann die Dissektion der MULTIP erfordernle Eierstöcke. Der ganze Vorgang sollte weniger als 15 Minuten. </li></ol> Hinweis: Es ist ratsam, einen Eierstock jeweils aus mehreren Fliegen anstatt Sezieren beide Eierstöcke von weniger Fliegen, um die n Anzahl der Fliegen für das Experiment zu erhöhen sezieren. Hinweis: Durch eine grobe Behandlung der Ovariole wird in ungesunden Eizellen führen und kann zu Artefakten im Experiment führen. Hinweis: Die Oocyten beginnt phänotypische Veränderungen aufgrund bis 40 Minuten nach dem aus dem Eierstock (vergleiche 7E bis F) seziert betonen anzuzeigen. <ol start="6"><li> Sobald Ovariolen in einer angemessenen Orientierung (Abbildung 3E) sind, verwenden Sie das Sezieren Sonde und geschlossenen Pinzette, um überschüssige Eierstockgewebe um aus dem Öl. Dieses Material kann von der Zange auf ein Papiertuch abgewischt werden. </li></ol> 4. Isolierung einzelner späten Stadium Ei Kammern (Nach E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Mit einer Pinzette in der Dominant der Hand, fassen Sie die hinteren eines isolierten Eierstock, vorzugsweise von den Resten des Bindegewebes. Halten Sie den Eierstock an Ort und Stelle mit der Zange, führen das Sezieren Sonde in das hintere Ende des Eierstocks in der Nähe der Zange (Abbildung 4A). Vermeiden Sie jegliche Punktierung Ei Kammern, die durch Einführen der Sonde zwischen späten Stadium Ei Kammern. </li><li> Ziehen Sie die Nadel durch das Sezieren Eierstock bis zum Austritt in einem frühen Stadium Ei Kammern (Abbildung 4B). Wenn es richtig gemacht, wird die Sonde entfernen Sie das Bindegewebe hält die Ovariolen und Spätstadium Eikammern an Ort und Stelle. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4,2, bis die Ovariolen auf dem Deckglas verteilt sind. Hinweis: Bei der Ei-Kammern nicht mehr auf übereinander gestapelt werden, ist dieser Schritt abgeschlossen. </li><li> Mit dem Sezieren Sonde, trennen Sie die Eizellen zu spät für eine einfache Bildgebung (4C) zu ermöglichen. </li></ol> Hinweis: Eine Punktion eine Eizelle während Sezieren späten Stadium Ei Kammern ist nicht so verurteilen, wie ich mit SezierenNDIVIDUELLE Ovariolen für jüngere Stadien. Hinweis: Bei Stufe 14 Eikammern, verwenden Sie die Zange, um die dorsalen Anhänge zur Orientierung zu erfassen. 5. Injektionspräparat Hinweis: Für die Injektion von Oozyten Mitte der Bühne, orientieren die Ovariolen senkrecht zur Längsachse des Deckglases. <ol><li> Schalten Sie den Imaging-Mikroskop [in unserem Fall eine DeltaVision Core von Applied Precision] und laden Sie die entsprechenden Einstellungen Bildgebung (5A-B). </li><li> Schalten des Injektionsgeräts (5C). </li><li> Laden Sie die Injektionsnadel mit Ladetipp (5D-E). Lösungen, die injiziert werden sollte kurz bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um Ablagerungen, die die Injektionsnadel blockieren könnten zu vermeiden. </li><li> Bringen Sie den geladenen Injektionsnadel in den Injektor. Achten Sie darauf, um nicht zu unterbrechen Sie die Nadel (5F). </li><li> Um mit dem Mähwerk Nadeln zu unterstützen, setzen Sie ein kleines Stück Glas aus einem 2x10 mm geschnitten oder gebrochen Deckglas einert eine Seite der Öltropfen mit den Ovariolen. Stellen Sie sicher, dieses Glas-Fragment in Öl bedeckt ist. Dieses Glas wird zu rammen die Nadelspitze gegen dienen zum Brechen von dem Mähwerk oder die Nadel. </li></ol> 6. Die Injektion von fluoreszierenden RNA Bevor Sie beginnen: Stellen Sie die Einspritzvorrichtung und Mikro-Manipulator Kontrollen, so dass die Injektionsnadel über der Mitte des Sichtfeldes positioniert ist. <ol><li> Montieren Sie die Probe, um auf dem Mikroskoptisch injiziert werden. </li><li> Wählen Sie das 20x-Objektiv. Höhere oder niedrigere Vergrößerung Ziele können ebenfalls verwendet werden. </li></ol> Hinweis: Bei Verwendung eines automatisierten Bühne mit Punkt Besuch Fähigkeit ist es ratsam, alle von der Bühne 8-9 Oozyten für die Injektion vor Beginn markieren. Dies ermöglicht eine einfache und besuchen Injektion von ausgewählten Oozyten. <ol start="3"><li> Senken Sie die Injektionsnadel bis sie das Öl berührt. Zentrieren Sie die Nadelspitze über dem Objektiv. </li><li> Drehenabseits der Raumbeleuchtung und schalten Sie das Hellfeld-Licht für das Mikroskop. Wählen Sie den ersten Punkt (Eizelle) auf der Liste markierten Punkten. Beim Blick durch die Okulare, auf die Eizelle (Abbildung 6A) zu konzentrieren. </li><li> Senken Sie die Nadel manuell, bis sie in der gleichen Ebene wie der Fokus der Eizelle und sichtbar neben der Eizelle ist. </li><li> Mit den Manipulator, bewegen Sie den Punkt der Injektionsnadel, bis es im Inneren der Eizelle ist. Eine schnelle stechende Bewegung ist oft erfolgreicher als einen langsamen Fortschritt. Einmal drinnen, Auswerfen eines kleinen Volumens von der Nadel und visuell beurteilen die Auswirkungen, je nach Bedarf wiederholen. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Zytoplasma der Eizelle im Inneren verdrängt werden, wenn dies nicht offensichtlich, wiederholen. Es ist nicht notwendig, um Bild der Fluoreszenz um festzustellen, ob Material eingespritzt wurde. Nach der Injektion entfernen Sie die Nadel aus dem Inneren der Eizelle (6B-G). </li><li> Die genaue Menge an Flüssigkeit eingespritzt wird, schwierig zu quantifizieren. Um das injizierte Volumen, einstellbar erhöhenst der Druck-oder Zeitpunkt der Injektion Puls, brechen Sie die Nadelspitze, um die Öffnung leicht erhöhen oder benutzen Sie wiederholte Injektion Impulse. </li></ol> Hinweis: Der gesamte Prozess sollte Injektion weniger als 10 Sekunden dauern, wenn richtig ausgeführt. Umfangreiche stechender oder Verweilen mit der Nadel im Inneren zu Eizelle führt zu schweren Schäden an der Ei Kammer führen. <ol start="8"><li> Vor der Auswahl des nächsten markierten Oozyte, erhöhen die Injektionsnadel hoch genug in dem Öl, um nicht anderen Oozyten in dem Transportweg zu kontaktieren. </li><li> Am neuen Eizelle, wiederholen Sie Schritt 6.6. Fahren Sie auf diese Weise, bis alle benötigten Eizellen injiziert werden. </li></ol> Hinweis: Wenn ein Fehler gemacht wird während der Injektion mit dem nächsten markiert Eizelle zu bewegen. Verschwenden Sie keine Zeit auf beschädigten Eizellen. Hinweis: Die Nadel kann verstopft werden während einer Injektion Sitzung. In diesem Fall verschieben Sie die Nadel neben dem zerbrochenen Stück Glas in der Öl-auf dem Deckglas. Witzh das Glas und die Nadel in der gleichen Bildebene, sanft rammen die Nadel in das Glas (Abb. 6H). Testen Sie, dass die Nadel, indem Sie den Injektionsknopf und zu sehen, wenn eine Flüssigkeit verlässt die Spitze der Nadel ist verstopft. <ol start="10"><li> Wenn alle Eizellen injiziert wurden, manuell verschieben Sie die Nadel auf, aus dem Öl und richten Sie ihn aus dem Strahlengang für das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass es an einem sicheren Orientierung ist, um Augenschäden zu vermeiden. </li></ol> Hinweis: Wenn eine erweiterte Zeitspanne zwischen Eikammer Isolierung und Oocyteninjektion verstrichen ist, wird es schwierig Oozyten zu injizieren und phänotypischen Veränderungen aufweisen mit Stress verbunden. Ähnliche Probleme können bei grober Handhabung der Eizelle oder Injektion von überschüssigen Mengen (vergleiche die Abbildungen 6I, J, K) ergeben. 7. Live-Imaging-experimentelles Design <ol><li> Wählen Sie das erste Eizelle injiziert aus der Liste. Testen Sie, ob die Injektion in die Eizelle war durch bildgebende einem Frame in der Fluoreszenz (eins in 6G). </li><li> Konfigurieren Sie die experimentellen Parameter, unter anderem: Anregungswellenlänge, Emissions-Weg, Zeit Anregung, Z-Stapel und die Zeit zwischen den Sammlungen. Hinweis: Weitere Informationen hierzu finden Sie Parton R., et al. (2010) 2. </li><li> Sammeln Sie die Datenmenge. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse In vitro synthetisiert Alexa-546 GRK-RNA in einer Me31B :: GFP Eikammer (7A) injiziert. Die RNA lokalisiert an der dorsalen vorderen der Eizelle und bildet eine Kappe um den Kern (7B). Weitere Beispiele für RNA Lokalisation siehe MacDougall N., et al. (2003) 11. Mitte und Ende der Etappe exprimierenden Oozyten fluoreszenzmarkierte Protein (Tau-GFP, 7C) oder RNA-Tagging-Systeme (GRK * mCherry, 7D) können ohne Injektion abgebildet werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Abbildung 1. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Abbildung 2. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Abbildung 3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Abbildung 4. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Abbildung 5. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Abbildung 6. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Abbildung 7.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

<html> Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Assay zur Untersuchung zellulärer Prozesse in Echtzeit. Neben der einfachen Hellfeld-Beobachtung hat der Zusatz von fluoreszierenden Markierungen an Proteine ​​und RNAs von Interesse führen zu vielen Durchbrüchen. Hier haben wir ein Protokoll für die Bildgebung individuelles Wohnen Eizellen, die in Kombination mit genetischen und biochemischen Assays genutzt werden können umrissen. In diesem Protokoll auch erklären, wie experimentell zu manipulieren lebenden Oozyten durch Injektion. Es gibt viele Möglichkeiten für das Material zu injizieren, einschließlich In-vitro synthetisiert fluoreszenzmarkierten RNA-Assay die Fähigkeit einer sekundären Struktur, um direkte RNA Körperregion (Ball und Davis, unveröffentlicht) und Antikörper, die die Funktion von Proteinen 6 inhibieren. Zukünftige Arbeiten werden wahrscheinlich sehen die Einführung anderer Etikettierung Komponenten und zelluläre Maschinerie zur lebenden Eizellen ermöglichen molekularen Mechanismen zu testen. t &quot;&gt; Die Erhaltung der Rentabilität und Lebensfähigkeit des Gewebes ist von wesentlicher Bedeutung bei der Arbeit mit lebenden Zellen. In diesem Protokoll, weisen wir darauf hin eine Reihe von Schritten, die auf Stress des Eies Kammer führen kann. Zum Beispiel, trotz Öl überlegen for Imaging, erweiterte Kulturbegriff in der Öl kann dazu führen, auf dem Ei Kammer zu betonen. Dies kann leicht unter Hellfeld Belichtung werden durch Untersuchung des Zellkerns und Position, Membran, die Eizelle zu verzerren und wird bleb unter Stress (vgl. Abbildung 7E (unbelasteten) zu Figure7F überwacht werden ( betonte)). Stage 9 Eikammern zeigen RNA Lokalisation und Grenze Zellmigration 12 über mehrere Stunden. jedoch ein Stadium 8.7 Eikammer beginnt zu negativen Auswirkungen in Halo Kohlenstoff Öl nach etwa 40 Minuten von den Eierstöcken entfernt von dem weisen weiblich. Spätstadium Eikammern, Stufe 11 bis 14, kann sich normal entwickeln entweder in Öl oder wässrigen Medien wegen der Sekretion der Eischale von den Follikelzellen in diesen Phasen 13. Es war Reported, dass die Zugabe von Insulin zu wässrigen Medium Insekten-Stufe 9 Oozyten bis zu 6 Stunden 14 und germaria bis zu 14 Stunden 15 aufrechtzuerhalten. In allen Fällen sollten aggressive Manöver des Eies Kammer vermieden werden, da sie die Eizellen betont und reduziert seine Lebensfähigkeit. Imaging weniger Ei Kammern und darauf achten, dass jeder vorsichtig zu behandeln ist der beste Weg, um eine optimale Rentabilität zu gewährleisten.

Werkzeuge in Dissektion verwendet sollte sauber sein, aber müssen nicht autoklaviert werden. Wischen Sie Werkzeuge mit EtOH und es ihnen ermöglichen, vor Beginn trocknen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Feine Spitzen Pinsel (Künstler Sable, rund, Größe 00 oder 0) </td><td> Von den meisten Verkaufsstellen Malutensilien </td><td></td><td> Eine gute Qualität ist wichtig, Pinsel </td></tr><tr><td> Halocarbon Products Corporation, Baureihe 95 </td><td> Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Europäische Händler: Solvadis (GMBH) Achten Sie darauf, Oxygenat durch Einblasen von Luft durch das Öl. </td></tr><tr><td> Deckglas-Nr. 1.5, 22 x 50mm </td><td> International-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; Spitze ist auch gut, aber zerbrechlicher </td></tr><tr><td> Dissecting Sonde </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Olymp </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2-Pad </td><td> Erhältlich über <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Ein Geschäftsbereich der Genesee Scientific) </td><td> 59-114 (789060 Dutscher) </td><td> Europäische Händler: www. dutscherscientific. com</a> / Es ist auch relativ einfach benutzerdefinierte bauen eine eigene Fliege Pads </td></tr><tr><td> Kimcare </td><td> Kimbery Clark-Kimcare-Medizinische Reinigungstücher </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> Burleigh Mikromanipulatoren von Lumen Dynamics Group Inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, Kanada L5N 6H7 </td><td> Burleigh PCS-5000-Serie, TS-5000 bis 300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Formerly Exfo) </td></tr><tr><td> Injektionsvorrichtung </td><td> Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Geändert mit einer Halterung zu nehmen Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> Injektionsnadel </td><td> Eppendorf Sterile Femtotips I und II </td><td> 930000043 </td><td> Verschiedene Tipps sind besser für unterschiedliche Anwendungen </td></tr><tr><td> Tipps zum Einlegen von 20 &amp;mgr; l </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Trockene aktive Hefe </td><td> Fleischmann Yeast </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

Live Cell Imaging ist eine wichtige Technik angewendet, um eine Reihe von Drosophila Gewebe als Modelle verwendet, um Themen wie Achsen-Spezifikation, die Zelldifferenzierung und Organogenese 1 zu untersuchen. Richtige Vorbereitung der experimentellen Proben ist ein wichtiger, jedoch oft vernachlässigte Schritt. Das Ziel der Vorbereitung ist es, physiologische Relevanz zu gewährleisten und optimale Aufnahmebedingungen zu schaffen. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten, ist es entscheidend zu Dehydratation, Hypoxie, Überhitzung oder Verschlechterung Medium 2 zu vermeiden. Die Drosophila-Ei Kammer ist ein gut etabliertes System zur Prüfung von Fragen im Zusammenhang, aber nicht beschränkt, um Körper Musterung, mRNA Lokalisation und Organisation des Zytoskeletts 3,4. Für Early-und Mid-Stage Ei Kammern, die Montage in Halocarbonöl ist gut für das Überleben, dass es freie Diffusion von Sauerstoff ermöglicht, verhindert das Austrocknen und Hypoxie und verfügt über hervorragende optische Eigenschaften für die Mikroskopie. ImAlterung der fluoreszierenden Proteinen besteht in der Einführung von Transgenen in das Ei Kammer oder physikalische Injektion von markierten RNA-, Protein oder Antikörper 5-7 möglich. Zum Beispiel erlaubt die Aufnahme MS2 Konstrukte in das Genom von Tieren Echtzeit-Beobachtung von mRNAs in der Eizelle 8. Diese Konstrukte können für in vivo-Markierung von mRNA durch Nutzung des MS2-Bakteriophagen-RNA-Stammschleife Interaktion mit dem Hüllprotein 9. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Extraktion von Eierstöcken sowie Isolierung einzelner Ovariolen und Ei Kammern aus der weiblichen Drosophila. Für eine detaillierte Beschreibung von Drosophila Oogenese siehe Allan C. Spradling (1993, neu aufgelegt 2009) 10.

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Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Ei Kammer ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der Mechanismen der mRNA-Lokalisierung. Um die dynamische Ereignisse, die die Prozesse der Lokalisierung untermauern zu erfassen, ist eine schnelle hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe erforderlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Bildgebung von Live-Proben mit minimalen Unterbrechungen.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

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Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.1K Aufrufe.  University of Oxford. Die Drosophila Ei Kammer ist ein ausgezeichnetes Modell für die Erforschung der Mechanismen der mRNA-Lokalisierung. Um die dynamische Ereignisse, die die Prozesse der Lokalisierung untermauern zu erfassen, ist eine schnelle hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe erforderlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Bildgebung von Live-Proben mit minimalen Unterbrechungen.

Serie: Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...