Wir danken Christine Holt und Bill Harris für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken Darren Gilmour für die fluoreszierenden Timer-Backbone-Konstrukte und Anna Huttenlocher für den Tol2-Lyz-Backbone-Vektor. Wir danken Steve Renshaw für die Tg(mpx:GFP)i114 Linie. Diese Arbeit wurde vom MRC (MR/L019523/1), dem Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] und ein Isaac Newton Trust Grant 19.23(n). C.C. wurde von einem MRC DTP-Stipendium und teilweise vom Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] gewähren. H.W. wurde von einem MRC DTP Studentship unterstützt. H.P. wurde durch ein Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) und teilweise durch einen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] Grant und das MRC (MR/L019523/1).

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt

Die beschriebene Methode ermöglicht eine Live-Bildgebung der Rezeptordynamik als Reaktion auf endogene Liganden in situ während einer Entzündungsreaktion auf Gewebeschäden. Die Verwendung von Cxcr1/Cxcr2-Neutrophilenreportern könnte auf andere physiologische Umgebungen wie Infektionen, Tumormodelle oder andere Arten von Gewebeschädenausgeweitet werden 14,25,26,27. Darüber hinaus könnten transgene Rettungslinien, bei denen der endogene Rezeptor von einem exogenen mutierten Rezeptor unterdrückt und gerettet wird, nützliche Werkzeuge liefern, um die Bedeutung spezifischer neutrophiler Migrationsmuster bei Immunantworten zu analysieren. Zum Beispiel verursachen Cxcr1-Rezeptor-Mutanten, die eine gestörte Desensibilisierung haben, eine prominentere Neutrophilen-Clusterbildung an Entzündungsstellen14. Dieser Funktionsgewinn-Phänotyp könnte verwendet werden, um die Rolle der Neutrophilenansammlung in verschiedenen physiologischen Prozessen zu verstehen, z. B. Wundreparatur, Infektionskrankheiten oder Tumorevolution, und Rezeptor-Knockdown- / Knockout-Experimente zu ergänzen. Die Methodik bietet auch eine Grundlage, um das Spektrum der verfügbaren Reporter zu erweitern. Die Wahl des fluoreszierenden Reporters ist wichtig zu berücksichtigen und hängt von der biologischen Frage ab. Wir fanden heraus, dass der konstitutive Umsatz dieser Chemokinrezeptoren in Neutrophilen im Vergleich zu Epithelzellen hoch warund dass Reporter mit schneller Reifung (z. B. sfGFP) verpflichtet waren, Membranspiegel im stationären Zustand zu melden und Unterschiede bei Neutrophilenstimulation aufzulösen 8,14. Daher sind Membranverhältnisse von sfGFP / tagRFP nicht anwendbar, um die ligandeninduzierte Internalisierung in diesem Zelltyp zu messen, aber das Muster von tagRFP ermöglicht die Verfolgung der intrazellulären Schicksale des Rezeptors, was in einigen Studien nützlich sein könnte. Wir fanden auch heraus, dass das konzentriertere intrazelluläre Signal von tagRFP für das Screening einzelner Larven nützlich ist. Ein alternativer Ansatz zur Messung der Rezeptorspiegel an der Plasmamembran wäre die Co-Expression eines fluoreszierenden Membranmarkers in Neutrophilen entweder im selben Transgen9 oder in einem unabhängigen Transgen14. Im ersten Szenario würde das Transgen ein zusätzliches Mittel für das Screening der Fische darstellen und die Expressionsniveaus wären zwischen dem Marker und dem Rezeptor vergleichbar. Der letztere Ansatz wäre modularer, da eine Zebrafischlinie mit einem Rezeptorreporter mit verschiedenen Reporterlinien kombiniert werden könnte. In beiden Fällen ist es erwähnenswert, dass die Membranquantifizierung der Rezeptorspiegel bei geclusterten Neutrophilen eine Herausforderung darstellt (siehe unten). Schließlich stellen wir fest, dass eine mögliche Erweiterung dieses Protokolls darin bestehen würde, die Live-Bildgebung durch Immunhistochemie für detailliertere Lokalisierungsanalysen zu verfolgen.
Das Tol2-Transgenesesystem ist gut etabliert7 und der Lysozym-C-Promotor wurde ausgiebig für die neutrophile Expression11,15 verwendet. Der Transgeneseansatz ist daher relativ einfach und das mit diesem Promotor erreichte Expressionsniveau ist hoch genug, um einen ausreichenden Kontrast für die Analyse der Rezeptordynamik zu bieten. Eine mögliche Einschränkung besteht darin, dass das Expressionsniveau nicht die endogenen Rezeptorexpressionsniveaus rekapituliert. Neue CRISPR-Technologien könnten eingesetzt werden, um Knock-in-Leitungen für Rezeptoren von besonderem Interessezu etablieren 28. Diese Technologien sind immer noch umständlich und garantieren möglicherweise nicht die erforderlichen Expressionsniveaus für die subzelluläre Bildgebung, aber ihre erfolgreiche Entwicklung wäre ein wichtiger Durchbruch für das Verständnis der endogenen Signaldynamik. Funktionelle Validierungen sind wichtig, um Daten mit transgenen Rezeptorkonstrukten zu interpretieren. Zum Beispiel können Ligandenerkennungsassays verwendet werden, um festzustellen, dass das fluoreszierende Fusionsprotein funktionell ist, und die Rettung von Knockout-Phänotypen könnte verwendet werden, um festzustellen, ob die transgenen neutrophilen Expressionsniveaus mit der Funktionalitätkompatibel sind 14. Schließlich wäre eine direktere Möglichkeit, die Rezeptorfusion zu validieren, die Verwendung eines in vitro funktionellen Assays mit markiertem Rezeptor neben nicht markierten Versionen14.
Der Quantifizierungsansatz adressiert spezifische Schwierigkeiten bei der genauen Membransegmentierung in Neutrophilen in vivo. In Zellen epithelialer Natur kann die Quantifizierung der Rezeptorspiegel automatisch durchgeführt werden, indem die Membranrezeptorspiegel auf einen Kontrollmarker normalisiert werden, der im Tandem oder separat ausgedrückt werden kann9. In der Tat haben wir einen solchen Ansatz angewandt, als wir den Ligandenerkennungsassay bei gastrulierenden Embryonen14 verwendeten. Neutrophile durchlaufen jedoch in vivo komplexe, schnelle Veränderungen der Zellform, was die Membransegmentierung sowohl in 2D als auch in 3Derschwert 14. Dies ist noch schwieriger, wenn sich Neutrophile häufen, was in vielen physiologischen Umgebungen vorkommt29. Die Kontrastmetrik überwindet diese Einschränkung, da sie keine Membransegmentierung erfordert, sondern den Gesamtzustand der Rezeptorverteilung in der Zelle widerspiegelt (membranös / glatt vs. vesikulär / punktförmig). Es ist wichtig zu beachten, dass die Kontrastmetrik durch den Gesamtkontrast des Bildes beeinflusst werden kann, so dass eine Normalisierung einzelner Zellwerte auf eine interne Referenz erforderlich ist, um die Variabilität des Signals in verschiedenen Embryonen / Proben zu berücksichtigen. Zum Beispiel verwendeten wir den mittleren Zellkontrastwert von nicht reagierenden Neutrophilen in der CHT (d.h. Neutrophilen, die stationär bleiben und nicht in die Bauchflosse wandern)14. Eine zusätzliche Möglichkeit wäre, mit Kontrastwerten eines Kontrollmarkers in derselben Zelle zu normalisieren. Dies würde eine Lösung bieten, wenn keine interne Referenz von nicht reagierenden Zellen verfügbar ist, und könnte wahrscheinlich feinere quantitative Unterschiede in der Rezeptordynamik zwischen verschiedenen Bedingungen auflösen.
Der Speicherort der Bildgebung ist eine weitere zu berücksichtigende Variable. Der Grund für die Wahl der Bauchflossenwunde hier, im Gegensatz zu der häufiger verwendeten Heckflossenwunde Modell16,30, ist, dass der Ort der Verwundung in der Nähe des Ortes des neutrophilen Wohnsitzes / Migrationsursprungs liegt. Dies beschleunigt die Zeitleiste des Assays, da es relativ wenig Zeit braucht, bis Neutrophile ankommen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, das Zellverhalten sowohl am Migrationsursprung (CHT) als auch am Zielort von Interesse (Wunde) zu erfassen. Dies ist hier relevant, da die räumliche und zeitliche Auflösung, die für die subzelluläre Bildgebung erforderlich ist, schwer mit einem großen Sichtfeld oder Multipositions-Scanning zu kombinieren ist. So erlaubt der ventrale Flossenwundassay die Verfolgung der Entwicklung der Migrationsreaktion vom Migrationsursprung und die gleichzeitige Erfassung unspezifischer Rezeptorschwankungen in Zellen, die nicht reagieren. Wie bereits erwähnt, ist letzteres für Quantifizierungszwecke nützlich, da es eine interne Referenz für unspezifische Dynamiken bietet. In anderen Systemen ist es möglicherweise nicht möglich, eine solche interne Referenz zu haben, in diesem Fall würden die Kontrastwerte eines co-exprimierten Membranmarkers eine alternative Kontrolle bieten.
Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Methodik auf andere Systeme anwendbar ist und für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt werden kann. Zum Beispiel könnten die gleichen Reporter in anderen entzündlichen Umgebungen wie Infektionseinstellungen oder anderen Krankheitsmodellen eingesetzt werden. Das Repertoire der Zebrafischrezeptor-Reporterlinien könnte auf andere Signalrezeptoren erweitert werden, um Signalmechanismen zu verstehen oder die Ligandendynamik in vivo zu melden. Der Ansatz kann mit Knockdown/Knockout-Techniken kombiniert werden, um die mechanistischen Grundlagen der beobachteten Dynamik zu hinterfragen. Zum Beispiel kann eine Störung der Ligandenexpression die Ligandenabhängigkeit für die beobachtete Rezeptordynamik anzeigen. In Zukunft stellen wir uns vor, dass das System weiter verfeinert werden könnte, um die Knock-in-Einfügung von Reportern zu integrieren. Letztendlich würden Ergebnisse, die diese Methodik verwenden, neue Erkenntnisse liefern, die über die Zebrafischgemeinschaft hinaus wertvoll sind, angesichts der Erhaltung dieser Signalrezeptoren bei Säugetieren und der relativen Herausforderung, diese Studien in größeren Organismen durchzuführen.

Die Leukozytenmigration ist von größter Bedeutung für die Immunantwort. Immunzellen sind prototypische wandernde Zellen, die bemerkenswert in der Lage sind, Gewebe und Blutgefäße zu durchqueren und eine Reihe von chemischen Führungshinweisen zu erfassen, um in Richtung Mikroben oder andere wichtige Wirtszellen zu wandern. Die korrekte Führung beruht auf der Erkennung von Chemolockstoffen, unter denen Chemokine die prominenteste Kategorie1 darstellen. Chemokine werden von hochspezifischen sieben-transmembranigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren erkannt. Bei der Chemokinbindung ändern Chemokinrezeptoren die Konformation, was zur Aktivierung assoziierter trimeraler G-Proteine und deren Dissoziation in funktionelle Signaluntereinheiten führt, die zytoskelettale Veränderungen und gerichtete Migration fördern1. Sekundär werden Chemokinrezeptoren phosphoryliert, und diese Modifikation führt zu einer Desensibilisierung des Lockstoffs, der eine schnelle Resensibilisierung / Recycling oder intrazellulärer Abbau und Herunterregulierung von der Zelloberfläche folgenkann 2. Diese Rezeptordynamik beeinflusst die Dauer und Dosis der Signalübertragung, die von den Zellen empfangen wird, aber wie sie das Migrationsverhalten der Leukozyten beeinflussen, war in vivo schwer zu erklären.
Die Verfolgung der Rezeptordynamik in lebenden Leukozyten in traditionellen Säugetiersystemen steht vor mehreren Herausforderungen. Für Lebendstudien müssen Rezeptorfusionen mit fluoreszierenden Proteinen in den Zellen exprimiert werden. Dies ist in primären Leukozyten, insbesondere bei Neutrophilen, eine Herausforderung, und Studien haben bisher Surrogat-Neutrophilen-Zelllinien verwendet, um Chemokinrezeptorenzu exprimieren 3,4. Die Generierung transgener Mausmodelle, in denen Leukozyten einen fluoreszierenden Rezeptor oder mutierte Rezeptoren mit informativen Trafficking-Defekten5,6 exprimieren, ist mit einem erheblichen Zeit- und Ressourcenaufwand verbunden. Selbst in diesen Fällen können die Bildgebungsauflösung und der Kontrast für die bildgebende Rezeptordynamik im lebenden Tier begrenzt sein, und Studien haben Immunhistochemie an fixierten Gewebeabschnitten5 verwendet. Angesichts dieser technischen Herausforderungen ist unser Verständnis darüber, wie die Dynamik von Chemoattraktorrezeptoren das Zellverhalten in einem lebenden Gewebe beeinflusst, derzeit begrenzt.
Hier stellen wir eine Methodik zur Überwachung des Rezeptorhandels in Zebrafisch-Neutrophilen vor. Zebrafische sind genetisch behandelbar, wie Mäuse, aber die Transgenese ist durch den Einsatz effizienter Transposonsysteme und direkter Zygotenmanipulation relativ einfach7. Die transparente Larve ist ideal bildgebend. Die Dynamik des Chemokinrezeptors wurde in primordialen Keimzellen und der Laterallinie Primordium durch Expression entsprechender Fusionen mit fluoreszierenden Reporternvisualisiert 8,9,10. Zebrafischlarven sind mit reifen Neutrophilen ausgestattet, die hochgradig konservierte genetische und zelluläre Eigenschaften in Bezug auf Neutrophile von Säugetieren aufweisen. Subzelluläre Signaldynamiken wie zytoskelettale Dynamik und Polaritätsregulatoren wurden in diesen Zellen durch die Erzeugung entsprechender transgener Linien11,12,13 visualisiert. Kürzlich haben wir die Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen im Verlauf von Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden visualisiert und funktionell analysiert14. Hier beschreiben wir die Erzeugung transgener Reporterlinien für die Chemokinsignalisierung in Neutrophilen, die Vorbereitung von Embryonen für die Live-Bildgebung, einen Wundassay zur Untersuchung der Neutrophilensignalisierung und das Protokoll für die Aufnahme und Analyse von Bildern. Wir bieten auch ein Nebenprotokoll zum Testen von Chemokinrezeptorreaktionen auf Kandidatenliganden, was nützlich ist, wenn versucht wird, Ligandenerkennungsmuster in nicht charakterisierten Rezeptoren zu etablieren. Diese Techniken können in Kombination mit weiteren genetischen Manipulationen, wie der Hemmung der endogenen Chemokinexpression oder der Erzeugung mutierter Rezeptoren mit verändertem Liganden-induziertem Trafficking, verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich spezifische Signaldynamiken auf das Verhalten von Leukozyten in vivo auswirken. Die transgenen Linien, die fluoreszierend markierte Chemokinrezeptoren exprimieren, können auch als Reporter für endogene Chemokingradienten verwendet werden, die sonst durch direkte Antikörperfärbung schwer nachzuweisen sind. Die beschriebene Methodik bietet Spielraum für die Ausweitung der Erzeugung von Reportern auf andere Immunsignalrezeptoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukozytenführung durch chemische Gradienten ist essentiell für Immunantworten. Neutrophile sind die ersten Zellen, die an Stellen von Gewebeschäden rekrutiert werden, wo sie entscheidende antimikrobielle Funktionen ausführen. Ihr Handel zu diesen Loci wird durch mehrere entzündliche Chemoattraktantien, einschließlich Chemokine, orchestriert. Auf molekularer Ebene wird die Chemoattraktus-Signalgebung durch den intrazellulären Transport der entsprechenden Rezeptoren reguliert. Es bleibt jedoch unklar, wie subzelluläre Veränderungen in Chemokinrezeptoren die Migrationsdynamik von Leukozyten auf Zell- und Gewebeebene beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Live-Bildgebung und quantitative Analyse der Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen während Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden. Diese Werkzeuge haben gezeigt, dass der differentielle Chemokinrezeptor-Verkehr in Zebrafisch-Neutrophilen die Neutrophilen-Clusterbildung und -Ausbreitung an Orten der Gewebeschädigung koordiniert. Dies hat Auswirkungen auf unser Verständnis, wie Entzündungsreaktionen selbstgelöst werden. Die beschriebenen Werkzeuge könnten verwendet werden, um neutrophile Migrationsmuster in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Umgebungen zu verstehen, und die Methodik könnte auf andere Signalrezeptoren ausgeweitet werden.

Auf die ventrale Flossenverwundung folgt eine schnelle Neutrophilenmobilisierung von der CHT in die Bauchflosse und eine Häufung am Wundrand innerhalb von 30-60 Minuten (Abbildung 1). Wir haben die Verteilung von zwei Chemokinrezeptoren, Cxcr1 und Cxcr2, visualisiert, die von Zebrafisch-Neutrophilen24 exprimiert werden und Cxcl8a und Cxcl8b14 mittels konfokaler Mikroskopie erkennen. Wir erzeugten zwei entsprechende transgene Linien, Tg(lyz:Cxcr1-FT) und Tg(lyz:Cxcr2-FT), in denen Neutrophile ein fluoreszierendes Timer-Konstrukt (FT) des Rezeptors exprimieren, d.h. eine Fusion mit einem Tandem aus sfGFP und tagRFP (Abbildung 2 und Referenz14). Die Verwendung der beiden Fluorophore sollte die Überwachung eines breiten Spektrums von Rezeptorschicksalen ermöglichen und Schätzungen der Proteinumsatzzeit an der Plasmamembran liefern, da neu synthetisierte Rezeptoren im Alter von 8,14 Jahren grün fluoreszieren und allmählich rot werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Rezeptoren einen schnellen konstitutiven Umsatz an der neutrophilen Plasmamembran aufweisen und dass die Verweilzeit kürzer war als die Reifezeit von tagRFP, wobei sfGFP eine Membranlokalisation und tagRFP eine vesikuläre Lokalisation im stationären Zustand zeigte (Ergänzendes Video 1 und Referenz14). Daher konzentrierten wir uns auf die Verteilung von sfGFP, um die ligandeninduzierte Internalisierung an Stellen von Gewebeschäden zu überwachen. Das Muster der Rezeptorverteilung wurde mit der Kontrastmetrik quantifiziert, die Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln meldet. Die Begründung ist, dass, wenn die Rezeptorverteilung membranös und glatt ist, der Kontrastwert niedrig ist. Wenn die Rezeptorverteilung vesikulär und punktförmiger ist, ist der Kontrastwert hoch (Abbildung 3).
Eine alternative Methode besteht darin, das Verhältnis von Rezeptorspiegeln (sfGFP-Intensität) zu den Spiegeln eines Kontrollmembranmarkers, z. B. Membran-CFP (mCFP), zu quantifizieren (Abbildung 3). Beide Methoden konnten die Rezeptorinternalisierung nachweisen, wie es durch ein stärkeres vesikuläres Rezeptorverteilungsmuster weltweit in der Zelle (höherer Kontrastwert) oder niedrigere Rezeptorspiegel an der Membran (niedrigeres sfGFP/mCFP-Verhältnis) angezeigt wird. Die Kontrastmetrik konnte jedoch auch die Rezeptorinternalisierung in Neutrophilenclustern an der Wunde nachweisen, in denen die Membransegmentierung weniger genau und nicht anwendbar war (Abbildung 3). Mit dieser Metrik konnten wir sichtbare Unterschiede zwischen dem Cxcr1- und Cxcr2-Handel mit Neutrophilen an Wunden quantifizieren (Abbildung 4 und ergänzendes Video 2). Cxcr1-FT internalisiert in Zellen an der Wunde, während Cxcr2-FT in Neutrophilen an der Wunde membranös blieb (Abbildung 4A-C, Supplementary Video 2 und Supplementary Video 3). Unterdrückung von Cxcl8a und Cxcl8b durch Morpholino-Behandlung, differentiell beeinflusste Cxcr1-FT-Internalisierung an Wunden (Abbildung 4C,D). Um weiter zu validieren, dass Cxcr1-FT auf Cxcl8a anspricht, führten wir Chemokin-Antwort-Assays in frühen Embryonen durch. Wir fanden heraus, dass Cxcr1-FT deutlich in Embryonen internalisiert wurde, in denen Cxcl8a co-exprimiert wurde (Abbildung 5). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die beschriebenen Methoden eingesetzt werden können, um die Chemokin-induzierte Rezeptorinternalisierung in Neutrophilen zu messen und die Identität des Liganden, der diese Effekte vermittelt, festzustellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Abbildung 1: Neutrophile Migration zu ventralen Flossenwunden. (A) (Links) Karikatur der 3 dpf-Larve, die die Lage des kaudalen hämatopoetischen Gewebes (CHT), der Venuszirkulation (VC, blau), der Bauchflosse (VF) und der Wundstelle zeigt. (Rechts) Karikatur, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellt, die von der CHT mobilisiert werden und sich an der Wunde gruppieren. Der Plexus caudalis cauda (CVP) des CHT-Gewebes ist blau gezeichnet. (B) Hellfeldbild (links) und konfokale Projektion (rechts), die die ventrale Flossenwunde und die Verteilung der Neutrophilen in Tg(mpx:GFP)-Larven bei 2 h nach der Wunde zeigt. Gestrichelte Linien zeigen VF- und CHT-Umrisse. Maßstabsleiste = 25 μm. Cartoon und fluoreszierendes Bild modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Abbildung 2: Live-Bildgebung des Handels von Chemokinrezeptoren in Neutrophilen. (A) Konstrukte, die für die neutrophilenspezifische transgene Expression von Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) und Cxcr2-FT verwendet werden. Konfokale Projektionen von Neutrophilen im Kopf einer 3 dpf transgenen Larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), oben; Tg(lyz:Cxcr2-FT), unten) mit tRFP (Magenta) und sfGFP (grün) Kanälen. Maßstabsleiste = 20 μm. (B) Anatomisches Schema von 3 dpf Larve wie in Abbildung 1A. Unterhalb der Larve befinden sich Schemata, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellen, die von der CHT (oben) mobilisiert werden oder beim Eintritt in die Bauchflosse (unten) Chemotaxis durchführen. Gestricheltes Quadrat zeigt den Bereich an, der in Schnappschüssen auf der rechten Seite abgebildet ist. (C) Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT)-Larven (sfGFP ist gezeigt) bei Mobilisierung von der CHT (obere Panels) oder Chemotaxis in Richtung der Wunde (untere Panels). Pfeile zeigen die gleichen Zellen im Laufe der Zeit. Zeitpunkte auf dem rechten Bild sind Minuten, die nach dem Bild auf der linken Seite verstrichen sind. Maßstabsstab = 10 μm. (D) Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes für die Live-Bildgebung des Chemokinrezeptor-Transports. Panels A-C modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierungsbeispiele der Rezeptordynamik. Einzelne (blaue) oder geclusterte Neutrophile (grün) an Wunden oder nicht mobilisierte Neutrophile in der CHT (rot, orange) wurden segmentiert und mit verschiedenen Methoden analysiert, um die Ergebnisse zu vergleichen. Die gleichen gezeigten Beispielzellen wurden mit zwei Methoden analysiert, um das, was im Bild zu sehen ist, mit dem extrahierten Wertebereich in Beziehung zu setzen. (A) Die Oberfläche der ausgewählten Beispielzellen wurde basierend auf der Konturdefinition im sfGFP-Kanal segmentiert. (B) Der Kontrast wurde aus den in A gezeigten Beispielzellen berechnet. (C) Die Membran der ausgewählten Beispielzellen wurde auf der Grundlage der Konturdefinition im CFP-Kanal segmentiert. Es folgte eine ratiometrische Analyse von sfGFP/CFP. (D) Das Verhältnis von sfGFP/CFP wurde an den in C gezeigten Beispielzellen berechnet. Fehlerbalken stellen S.E.M. aus einzelnen Zellen dar, im Fall von n>1 wurden die Werte hier nicht für statistische Analysen verwendet, sondern lediglich als Beispiel für Messungen, die mit den verschiedenen Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Differentialdynamik von Cxcr1 und Cxcr2 als Reaktion auf Verwundung. (A) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT)- oder Tg(lyz:Cxcr2-FT)-Larven an der Wunde bei 80 min nach der Wunde (sfGFP-Kanal gezeigt). Maßstabsleiste = 10 μm.  (B) Vergrößertes Cxcr1-FT-Neutrophil (links) und Cxcr2-FT (rechts) an der Wunde. Grüner Rezeptor ist in Grau dargestellt. Skalenbalken = 5 μm. (C) Normalisierter Kontrast (Kontrast pro individuellem Neutrophilen, normalisiert auf den mittleren Kontrast von nicht mobilisierten Zellen in der CHT). CXCl8A bezieht sich auf die Injektion eines Spleißblockers zusammen mit einem translationsblockierenden Morpholino für CXCL8A. CXCl8B bezieht sich auf die Injektion mit einem Spleiß-blockierenden Morpholino für CXCl8B. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 Zellen (CHT), n=47 Zellen (Wunde) von 8 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT) mit Morpholinos: n=28 Zellen (Cxcl8a-MO) aus 5 Larven, n=16 Zellen (Cxcl8b-MO) aus 5 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 Zellen (CHT) und n=20 Zellen (Wunde) aus 3 Larven. Die Daten wurden von unabhängigen Larven gepoolt, die in 1-5 Bildgebungssitzungen aufgenommen wurden. Kruskal-Wallis-Test mit Dunns multiplem Vergleichstest für Tg(lyz:Cxcr1-FT), zweiseitiger ungepaarter Mann-Whitney-Test für Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgenen Larven, die mit cxcl8a morpholino (MO) (links) und cxcl8b MO (rechts) behandelt wurden, die auf Flossenwunden ansprechen (sfGFP-Kanal grün dargestellt). Schnappschuss aufgenommen zu Zeitpunkten äquivalenter Neutrophilenakkumulation (85 min nach der Verwundung im linken Bild und 45 min nach der Verwundung im rechten Bild). Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Abbildung 5: Chemokin-Response-Assay in frühen Embryonen. Laserscanning konfokaler Scheiben von gastrulatierenden Embryonen, die Expression und Verteilung von Cxcr1-FT zeigen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA wurden in ein Zellstadium Eizellen mit oder ohne 150 pg Cxcl8a mRNA injiziert. Grüne und rote Rezeptoren werden in separaten Kanälen gezeigt. Der Kontrollmembran-CFP-Marker (mCFP) ist im Cyan-Kanal dargestellt. Maßstabsleiste = 20 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatzfilm 1: Transgene Neutrophile im Kopf einer Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) Larve bei 3 dpf. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 5 fps. Maßstabsleiste = 20 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 2: Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgenen Larven, die auf Flossenwunden reagieren. Der Film beginnt innerhalb von 10 Minuten nach der Wunde und dauert 60 Minuten. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 10 fps. CHT = kaudales hämatopoetisches Gewebe. VF = Bauchflosse. Maßstabsleiste = 25 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 3. Zusätzliche Beispiele von Neutrophilen aus einer verwundeten transgenen Tg(lyz:Cxcr1- FT)-Larve (andere Larve als in Video 2), die mit höherer Auflösung aufgenommen wurden und eine Rezeptorinternalisierung (sfGFP-Kanal grün dargestellt) bei Mobilisierung in der CHT oder beim Eintritt und Chemotaxis in der Bauchflosse zeigen. Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 2 fps. Maßstabsleiste = 10 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
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Ergänzungsdatei 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Aufrufe.  University of Cambridge. Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Serie: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

Zusammenfassung

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