Agradecemos a Christine Holt y Bill Harris por su ayuda con la microscopía confocal. Agradecemos a Darren Gilmour por las construcciones de la columna vertebral del temporizador fluorescente y a Anna Huttenlocher por el vector de la columna vertebral Tol2-Lyz. Agradecemos a Steve Renshaw por la línea Tg(mpx:GFP)i114 . Esta labor contó con el apoyo del MRC (MR/L019523/1), el Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y una subvención de Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. contó con el apoyo de una beca de MRC DTP y en parte del Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvención. H.W. fue apoyado por un MRC DTP Studentship. H.P. fue apoyado por una beca de doctorado de Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) y en parte por un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Subvención del Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y el MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses

El método descrito permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los receptores en respuesta a ligandos endógenos in situ durante una respuesta inflamatoria al daño tisular. El uso de reporteros de neutrófilos Cxcr1/Cxcr2 podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como infecciones, modelos tumorales u otros tipos de daño tisular 14,25,26,27. Además, las líneas de rescate transgénico, en las que el receptor endógeno es suprimido y rescatado por un receptor mutante exógeno, podrían proporcionar herramientas útiles para diseccionar la importancia de los patrones específicos de migración de neutrófilos en las respuestas inmunes. Por ejemplo, los mutantes del receptor Cxcr1 que tienen una desensibilización deteriorada causan agrupamiento de neutrófilos más prominente en los sitios inflamatorios14. Esta ganancia de fenotipo de función podría usarse para comprender el papel de la congregación de neutrófilos en diferentes procesos fisiológicos, por ejemplo, reparación de heridas, enfermedades infecciosas o evolución tumoral, y experimentos de derribo / eliminación de receptores del complemento. La metodología también proporciona una base para ampliar la gama de reporteros disponibles. La elección del reportero fluorescente es importante de considerar y depende de la cuestión biológica. Encontramos que el recambio constitutivo de estos receptores de quimiocinas en neutrófilos fue alto, en comparación con las células epiteliales, y que los reporteros con maduración rápida (p.ej., sfGFP) debían informar los niveles de membrana en estado estacionario y resolver las diferencias tras la estimulación de neutrófilos 8,14. Por lo tanto, las proporciones de membrana de sfGFP / tagRFP no son aplicables para medir la internalización inducida por ligandos en este tipo de célula, pero el patrón de tagRFP permite el seguimiento de los destinos intracelulares del receptor, lo que podría ser útil en algunos estudios. También encontramos que la señal intracelular más concentrada de tagRFP es útil para la detección de larvas individuales. Un enfoque alternativo para medir los niveles de receptores en la membrana plasmática sería coexpresar un marcador de membrana fluorescente en neutrófilos, ya sea en el mismo transgén9 o en un transgén14 independiente. En el primer escenario, el transgén proporcionaría un medio adicional para examinar a los peces y los niveles de expresión serían comparables entre el marcador y el receptor. Este último enfoque sería más modular, ya que una línea de pez cebra con un reportero receptor podría combinarse con diferentes líneas de reportero. En cualquier caso, vale la pena señalar que la cuantificación de la membrana de los niveles del receptor es un desafío en los neutrófilos agrupados (ver más abajo). Finalmente, observamos que una posible extensión de este protocolo sería hacer un seguimiento de las imágenes en vivo por inmunohistoquímica para análisis de localización más detallados.
El sistema de transgénesis Tol2 está bien establecido7 y el promotor de lisozima C se ha utilizado ampliamente para la expresión de neutrófilos11,15. El enfoque de transgénesis es, por lo tanto, relativamente sencillo y el nivel de expresión alcanzado con este promotor es lo suficientemente alto como para proporcionar suficiente contraste para el análisis de la dinámica del receptor. Una posible limitación es que el nivel de expresión no recapitula los niveles de expresión del receptor endógeno. Se podrían implementar nuevas tecnologías CRISPR para establecer líneas de llamada para receptores de particular interés28. Estas tecnologías siguen siendo engorrosas y pueden no garantizar los niveles de expresión requeridos para las imágenes subcelulares, pero su desarrollo exitoso sería un avance importante para comprender la dinámica de señalización endógena. Las validaciones funcionales son importantes para interpretar los datos con construcciones de receptores transgénicos. Por ejemplo, los ensayos de reconocimiento de ligandos se pueden utilizar para establecer que la proteína de fusión fluorescente es funcional y el rescate de fenotipos knockout podría utilizarse para establecer que los niveles de expresión de neutrófilos transgénicos son compatibles con la funcionalidad14. Finalmente, una forma más directa de validar la fusión del receptor sería utilizar un ensayo funcional in vitro con receptor etiquetado junto con las versiones no marcadas14.
El enfoque de cuantificación aborda dificultades específicas en la segmentación precisa de la membrana en neutrófilos in vivo. En células de naturaleza epitelial, la cuantificación de los niveles de receptores se puede ejecutar automáticamente normalizando los niveles de receptores de membrana a un marcador de control, que se puede expresar en tándem o por separado9. De hecho, hemos aplicado este enfoque, al utilizar el ensayo de reconocimiento de ligandos en embriones gastrulatantes14. Sin embargo, los neutrófilos experimentan cambios complejos y rápidos en la forma de la célula in vivo, lo que dificulta la segmentación de la membrana tanto en 2D como en 3D14. Esto es aún más difícil cuando los neutrófilos se agrupan, lo que ocurre en muchos entornos fisiológicos29. La métrica de contraste supera esta limitación, ya que no requiere segmentación de membrana, sino que refleja el estado general de distribución del receptor en la célula (membranoso / liso vs vesicular / puntiagudo). Es importante tener en cuenta que la métrica de contraste puede verse afectada por el contraste general de la imagen, por lo que se requiere la normalización de los valores celulares individuales a una referencia interna para tener en cuenta la variabilidad de la señal en diferentes embriones / muestras. Por ejemplo, utilizamos el valor medio de contraste celular de neutrófilos no sensibles en la CHT (es decir, neutrófilos que permanecen estacionarios y no migran a la aleta ventral)14. Una posibilidad adicional sería normalizar con valores de contraste de un marcador de control en la misma celda. Esto proporcionaría una solución cuando no se dispone de una referencia interna de células que no responden y es probable que resuelva diferencias cuantitativas más finas en la dinámica del receptor entre diferentes afecciones.
La ubicación de las imágenes es otra variable a considerar. La razón para elegir la herida de la aleta ventral aquí, a diferencia del modelo de herida de la aleta caudal más comúnmente utilizado16,30, es porque el sitio de la herida está cerca del sitio de residencia de neutrófilos / origen migratorio. Esto acelera la línea de tiempo del ensayo, ya que los neutrófilos tardan relativamente poco tiempo en llegar. Además, brinda la oportunidad de capturar el comportamiento celular tanto en el origen de la migración (CHT) como en la ubicación objetivo de interés (herida). Esto es relevante aquí, porque la resolución espacial y temporal requerida para las imágenes subcelulares es difícil de combinar con un gran campo de visión o escaneo de múltiples posiciones. Así, el ensayo de herida de aleta ventral permite rastrear la evolución de la respuesta migratoria desde el origen migratorio y la captura simultánea de fluctuaciones inespecíficas del receptor en células que no responden. Como se mencionó anteriormente, este último es útil para fines de cuantificación, ya que proporciona una referencia interna para dinámicas inespecíficas. En otros sistemas, puede que no sea posible disponer de una referencia interna de este tipo, en cuyo caso los valores de contraste de un marcador de membrana coexpresado proporcionarían un control alternativo.
En resumen, anticipamos que la metodología es aplicable a otros sistemas y se puede implementar para una variedad de propósitos. Por ejemplo, los mismos reporteros podrían utilizarse en otros entornos inflamatorios, como entornos de infección u otros modelos de enfermedad. El repertorio de líneas reporteras de receptores de pez cebra podría ampliarse a otros receptores de señalización, para comprender los mecanismos de señalización o informar sobre la dinámica del ligando in vivo. El enfoque se puede combinar con técnicas de derribo / nocaut para interrogar la base mecanicista de la dinámica observada. Por ejemplo, la perturbación de la expresión del ligando puede indicar la dependencia del ligando para la dinámica del receptor observada. En el futuro, prevemos que el sistema podría perfeccionarse aún más para incorporar la inserción de reporteros. En última instancia, los hallazgos que utilizan esta metodología proporcionarían nuevos conocimientos valiosos más allá de la comunidad del pez cebra, dada la conservación de estos receptores de señalización en mamíferos y el desafío relativo de realizar estos estudios en organismos más grandes.

La migración de leucocitos es de suma importancia para las respuestas inmunes. Las células inmunes son células migratorias prototípicas, que son notablemente capaces de atravesar tejidos y vasos sanguíneos y detectar una serie de señales de guía química para migrar direccionalmente hacia microbios u otras células huésped de importancia. La orientación correcta se basa en el reconocimiento de quimioatrayentes, entre los cuales las quimiocinas representan la categoría1 más prominente. Las quimiocinas son reconocidas por receptores altamente específicos acoplados a la proteína G de siete transmembranas. Tras la unión a quimiocinas, los receptores de quimiocinas cambian la conformación, lo que lleva a la activación de las proteínas G triméricas asociadas y su disociación en subunidades de señalización funcional que promueven cambios citoesqueléticos y migración dirigida1. Secundariamente, los receptores de quimiocinas están fosforilados, y esta modificación conduce a la desensibilización al atrayente, que puede ser seguida por una rápida resensibilización / reciclaje o degradación intracelular y regulación descendente de la superficie celular2. Esta dinámica de los receptores influye en la duración y la dosis de señalización recibida por las células, pero la forma en que afectan el comportamiento de migración de leucocitos ha sido difícil de dilucidar in vivo.
El seguimiento de la dinámica de los receptores en leucocitos vivos en sistemas tradicionales de mamíferos se enfrenta a varios desafíos. Para los estudios en vivo, las fusiones de receptores con proteínas fluorescentes deben expresarse en las células. Esto es un desafío en los leucocitos primarios, particularmente en neutrófilos, y los estudios hasta ahora han utilizado líneas celulares de neutrófilos sustitutos para expresar los receptores de quimiocinas 3,4. La generación de modelos de ratón transgénico, en los que los leucocitos expresan un receptor fluorescente o receptores mutantes con defectos de tráfico informativos 5,6, conlleva una considerable inversión de tiempo y recursos. Incluso en estos casos, la resolución de imágenes y el contraste para la dinámica de los receptores de imágenes en el animal vivo pueden ser limitados y los estudios han utilizado inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo5. Dados estos desafíos técnicos, nuestra comprensión de cómo la dinámica de los receptores quimioatrayentes afecta el comportamiento celular en un entorno de tejido vivo es actualmente limitada.
Aquí proporcionamos una metodología para monitorear el tráfico de receptores en neutrófilos de pez cebra. Los peces cebra son genéticamente tratables, como los ratones, pero la transgénesis es relativamente más sencilla mediante el uso de sistemas de transposones eficientes y la manipulación directa decigotos 7. La larva transparente es idealmente susceptible de imágenes. La dinámica del receptor de quimiocinas se ha visualizado en células germinales primordiales y en la línea lateral primordium mediante la expresión de fusiones correspondientes con reporteros fluorescentes 8,9,10. Las larvas de pez cebra están equipadas con neutrófilos maduros que tienen propiedades genéticas y celulares altamente conservadas con respecto a los neutrófilos de mamíferos. La dinámica de señalización subcelular como la dinámica citoesquelética y los reguladores de polaridad se han visualizado en estas células mediante la generación de las líneas transgénicas correspondientes 11,12,13. Recientemente, visualizamos y analizamos funcionalmente la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante el curso de las respuestas inflamatorias al daño tisular14. Aquí, describimos la generación de líneas reporteras transgénicas para la señalización de quimiocinas en neutrófilos, la preparación de embriones para imágenes en vivo, un ensayo de heridas para el estudio de la señalización de neutrófilos y el protocolo para la adquisición y análisis de imágenes. También proporcionamos un protocolo lateral para probar las respuestas de los receptores de quimiocinas a los ligandos candidatos, que es útil cuando se trata de establecer patrones de reconocimiento de ligandos en receptores no caracterizados. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación con otras manipulaciones genéticas, como la inhibición de la expresión endógena de quimiocinas o la generación de receptores mutantes con tráfico alterado inducido por ligandos, para interrogar cómo la dinámica de señalización específica afecta el comportamiento de los leucocitos in vivo. Las líneas transgénicas que expresan receptores de quimiocinas marcados fluorescentemente también se pueden usar como reporteros para gradientes endógenos de quimiocinas, que de otro modo son difíciles de detectar por tinción directa de anticuerpos. La metodología descrita proporciona un margen para ampliar la generación de reporteros a otros receptores de inmunocopuntía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

La guía de leucocitos por gradientes químicos es esencial para las respuestas inmunes. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas en sitios de daño tisular donde ejecutan funciones antimicrobianas cruciales. Su tráfico a estos loci está orquestado por varios quimioatrayentes inflamatorios, incluidas las quimiocinas. A nivel molecular, la señalización quimioatrayente está regulada por el tráfico intracelular de los receptores correspondientes. Sin embargo, no está claro cómo los cambios subcelulares en los receptores de quimiocinas afectan la dinámica de migración de leucocitos a nivel celular y tisular. Aquí describimos una metodología para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante las respuestas inflamatorias al daño tisular. Estas herramientas han revelado que el tráfico diferencial de receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra coordina la agrupación y dispersión de neutrófilos en sitios de daño tisular. Esto tiene implicaciones para nuestra comprensión de cómo las respuestas inflamatorias se auto-resuelven. Las herramientas descritas podrían utilizarse para comprender los patrones de migración de neutrófilos en una variedad de entornos fisiológicos y patológicos y la metodología podría ampliarse a otros receptores de señalización.

La herida de la aleta ventral es seguida por una rápida movilización de neutrófilos desde el CHT hacia la aleta ventral y la agrupación en el margen de la herida, dentro de los 30-60 min (Figura 1). Visualizamos la distribución de dos receptores de quimiocinas, Cxcr1 y Cxcr2, que son expresados por los neutrófilos de pez cebra24 y reconocen Cxcl8a y Cxcl8b14, utilizando microscopía confocal de disco giratorio. Generamos dos líneas transgénicas correspondientes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) y Tg(lyz:Cxcr2-FT), en las que los neutrófilos expresan un constructo de temporizador fluorescente (FT) del receptor, es decir, una fusión con un tándem de sfGFP y tagRFP (Figura 2 y referencia14). El uso de los dos fluoróforos estaba destinado a permitir el monitoreo de una amplia gama de destinos de receptores y proporcionar estimaciones del tiempo de renovación de proteínas en la membrana plasmática, ya que los receptores recién sintetizados fluorescen en verde y progresivamente se volverían rojos a medida que envejecen 8,14. Sin embargo, se encontró que estos receptores tenían un rápido recambio constitutivo en la membrana plasmática de neutrófilos y que el tiempo de residencia era más corto que el tiempo de maduración de tagRFP, con sfGFP mostrando localización de membrana y tagRFP mostrando localización vesicular en estado estacionario (Video suplementario 1 y ref14). Por lo tanto, nos centramos en la distribución de sfGFP para monitorear la internalización inducida por ligandos en sitios de daño tisular. El patrón de distribución del receptor se cuantificó utilizando la métrica de contraste, que informa las diferencias de intensidad entre los píxeles vecinos. La razón es que cuando la distribución del receptor es membranosa y suave, el valor de contraste es bajo. Cuando la distribución del receptor es vesicular y más punteada, entonces el valor de contraste es alto (Figura 3).
Un método alternativo es cuantificar la relación entre los niveles de receptores (intensidad de sfGFP) sobre los niveles de un marcador de membrana de control, por ejemplo, CFP de membrana (mCFP) (Figura 3). Ambos métodos podrían detectar la internalización del receptor, como lo indica un patrón de distribución de receptores vesiculares más globalmente en la célula (mayor valor de contraste) o niveles más bajos de receptores en la membrana (menor relación sfGFP / mCFP). Sin embargo, la métrica de contraste también pudo detectar la internalización del receptor en grupos de neutrófilos en la herida, en los que la segmentación de la membrana fue menos precisa y no aplicable (Figura 3). Utilizando esta métrica, pudimos cuantificar las diferencias visibles entre el tráfico de Neutrófilos en las heridas de Cxcr1 y Cxcr2 (Figura 4 y Video Complementario 2). Cxcr1-FT internalizado en células localizadas en la herida, mientras que Cxcr2-FT permaneció membranoso en neutrófilos en la herida (Figura 4A-C, Video Suplementario 2 y Video Suplementario 3). La supresión de Cxcl8a y Cxcl8b, mediante tratamiento con morfolino, afectó diferencialmente la internalización de Cxcr1-FT en las heridas (Figura 4C,D). Para validar aún más que Cxcr1-FT responde a Cxcl8a, realizamos ensayos de respuesta de quimiocinas en embriones tempranos. Encontramos que Cxcr1-FT se interiorizó marcadamente en embriones en los que Cxcl8a fue coexpresado (Figura 5). En conjunto, estos resultados indican que los métodos descritos se pueden implementar para medir la internalización del receptor inducida por quimiocinas en neutrófilos y establecer la identidad del ligando que media estos efectos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migración de neutrófilos a heridas de aleta ventral. (A) (Izquierda) Caricatura de larva de 3 dpf que muestra la ubicación del tejido hematopoyético caudal (CHT), la circulación de venus (VC, azul), la aleta ventral (VF) y el sitio de la herida. (Derecha) Caricatura que representa el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT y se agrupan en la herida. El plexo de la vena caudal (CVP) del tejido CHT se dibuja en azul. (B) Imagen de campo brillante (izquierda) y proyección confocal (derecha) que muestra la herida de la aleta ventral y la distribución de neutrófilos en larvas de Tg (mpx: GFP) a las 2 h después de la herida. Las líneas discontinuas muestran los contornos vf y CHT. Barra de escala = 25 μm. Caricatura e imagen fluorescente modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas en neutrófilos. (A) Constructos utilizados para la expresión transgénica específica de neutrófilos de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) y Cxcr2-FT. Proyecciones confocales de neutrófilos en la cabeza de una larva transgénica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), arriba; Tg(lyz:Cxcr2-FT), abajo) mostrando los canales tRFP (magenta) y sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatómico de larva de 3 dpf como en la Figura 1A. Debajo de la larva hay esquemas que representan el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT (parte superior) o realizan quimiotaxis al ingresar a la aleta ventral (abajo). El cuadrado discontinuo indica el área fotografiada en instantáneas a la derecha. (C) Neutrófilos en larvas de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (se muestra sfGFP) al movilizarse desde el CHT (paneles superiores) o quimiotaxis hacia la herida (paneles inferiores). Las flechas muestran las mismas celdas a lo largo del tiempo. Los puntos de tiempo en la imagen de la derecha son minutos transcurridos después de la imagen de la izquierda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representación esquemática del enfoque experimental para la obtención de imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas. Paneles A-C modificados de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Ejemplos de cuantificación de la dinámica de los receptores. Los neutrófilos individuales (azules) o agrupados (verdes) en las heridas o los neutrófilos no movilizados en el CHT (rojo, naranja) fueron segmentados y analizados por diferentes métodos para comparar los resultados. Las mismas celdas de ejemplo mostradas fueron analizadas con dos métodos para relacionar lo que se ve en la imagen con el rango de valores extraídos. (A) La superficie de las celdas de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal sfGFP. (B) El contraste se calculó a partir de las células de ejemplo que se muestran en A. (C) La membrana de las células de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal CFP. Se siguió un análisis ratiométrico de sfGFP/CFP. (D) La relación sfGFP/CFP se calculó sobre las celdas de ejemplo que se muestran en C. Las barras de error representan S.E.M. a partir de celdas individuales, en casos de n>1, los valores aquí no se utilizaron para el análisis estadístico sino simplemente para ejemplificar las mediciones obtenidas con los diferentes métodos de cuantificación. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinámica diferencial de Cxcr1 y Cxcr2 en respuesta a heridas. (A) Proyección confocal de neutrófilos en larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) en la herida a los 80 min post-herida (se muestra el canal sfGFP). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT magnificado (izquierda) y Cxcr2-FT (derecha) en la herida. El receptor verde se muestra en gris. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado al contraste medio de células no movilizadas en el CHT). cxcl8a se refiere a la inyección de un bloqueo de empalme junto con un morfolino que bloquea la traslación para cxcl8a. cxcl8b se refiere a la inyección con un morfolino que bloquea el empalme para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (herida) de 8 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) y n=20 células (herida) de 3 larvas. Los datos se agruparon a partir de larvas independientes adquiridas en 1-5 sesiones de imágenes. Prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para Tg(lyz:Cxcr1-FT), prueba de Mann-Whitney de dos colas sin aparear para Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Proyección confocal de neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) tratadas con cxcl8a morfolino (MO) (izquierda) y cxcl8b MO (derecha) respondiendo a heridas en las aletas (canal sfGFP mostrado en verde). Instantánea tomada en puntos de tiempo de acumulación equivalente de neutrófilos (85 min post-herida en la imagen izquierda y 45 min post-herida en la imagen derecha). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensayo de respuesta a quimiocinas en embriones tempranos. Se inyectaron cortes confocales de barrido láser de embriones gastrulatantes que muestran expresión y distribución de Cxcr1-FT. Se inyectaron 100 pg de ARNm Cxcr1-FT en un óvulo en etapa celular con o sin ARNm Cxcl8a de 150 pg. Los receptores verde y rojo se muestran en canales separados. El marcador CFP de membrana de control (mCFP) se muestra en el canal cian. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película suplementaria 1: Neutrófilos transgénicos en la cabeza de una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película complementaria 2: Neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) que responden a heridas en las aletas. La película comienza dentro de los 10 minutos posteriores a la herida y dura 60 minutos sfGFP (verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 10 fps. CHT = tejido hematopoyético caudal. VF = aleta ventral. Barra de escala = 25 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película suplementaria 3. Ejemplos adicionales de neutrófilos de una larva transgénica Tg(lyz:Cxcr1- FT) herida (larva diferente a la que se muestra en el Video 2), adquirida a mayor resolución, mostrando internalización del receptor (canal sfGFP mostrado en verde) al movilizarse en el CHT o al ingresar y quimiotaxis en la aleta ventral. El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Archivo complementario 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra

Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K vistas.  University of Cambridge. Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra

Video: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.