Christine Holt ve Bill Harris'e konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Floresan zamanlayıcı omurga yapıları için Darren Gilmour'a ve Tol2-Lyz omurga vektörü için Anna Huttenlocher'e teşekkür ederiz. Steve Renshaw'a Tg(mpx:GFP)i114 serisi için teşekkür ederiz. Bu çalışma MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] ve bir Isaac Newton Trust hibesi 19.23(n). C.C., MRC DTP öğrenciliği ve kısmen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] tarafından desteklendi; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe. H.W. MRC DTP Studentship tarafından desteklendi. H.P., Wellcome Trust doktora hibesi (105391 / Z / 14 / Z) ve kısmen bir Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z] tarafından desteklenmiştir; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe ve MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler

Tarif edilen yöntem, doku hasarına inflamatuar yanıt sırasında endojen ligandlara in situ yanıt olarak reseptör dinamiklerinin canlı görüntülenmesini sağlar. Cxcr1 / Cxcr2 nötrofil muhabirlerinin kullanımı, enfeksiyon, tümör modelleri veya diğer doku hasarı türleri gibi diğer fizyolojik ortamlara genişletilebilir 14,25,26,27. Ek olarak, endojen reseptörün eksojen bir mutant reseptör tarafından bastırıldığı ve kurtarıldığı transgenik kurtarma hatları, immün yanıtlarda spesifik nötrofil migrasyon paternlerinin önemini incelemek için yararlı araçlar sağlayabilir. Örneğin, duyarsızlaştırmayı bozan Cxcr1 reseptör mutantları, enflamatuar bölgelerde daha belirgin nötrofil kümelenmesine neden olur14. Bu fonksiyon kazancı fenotipi, nötrofil cemaatinin farklı fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için kullanılabilir, örneğin, yara onarımı, bulaşıcı hastalık veya tümör evrimi ve kompleman reseptör nakavt / nakavt deneyleri. Metodoloji ayrıca mevcut muhabirlerin aralığını genişletmek için bir temel sağlar. Floresan muhabir seçimi dikkate alınması önemlidir ve biyolojik soruya bağlıdır. Nötrofillerdeki bu kemokin reseptörlerinin kurucu döngüsünün, epitel hücrelerine kıyasla yüksek olduğunu ve hızlı olgunlaşması olan muhabirlerin (örneğin, sfGFP) membran seviyelerini kararlı durumda bildirmeleri ve nötrofil stimülasyonuüzerindeki farklılıkları çözmeleri gerektiğini bulduk8,14. Bu nedenle, sfGFP / tagRFP'nin membran oranları, bu hücre tipinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi ölçmek için geçerli değildir, ancak tagRFP paterni, bazı çalışmalarda yararlı olabilecek reseptörün hücre içi kaderlerinin izlenmesine izin verir. Ayrıca, tagRFP'nin daha konsantre hücre içi sinyalinin bireysel larvaları taramak için yararlı olduğunu bulduk. Plazma zarındaki reseptör seviyelerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, nötrofillerdeki bir floresan membran belirtecini aynı transgen9'da veya bağımsız bir transgen14'te birlikte eksprese etmek olacaktır. Önceki senaryoda, transgen balığın taranması için ek bir araç sağlayacak ve ekspresyon seviyeleri belirteç ve reseptör arasında karşılaştırılabilir olacaktır. İkinci yaklaşım daha modüler olacaktır, çünkü bir reseptör muhabiri olan bir zebra balığı çizgisi farklı muhabir hatlarıyla birleştirilebilir. Her iki durumda da, kümelenmiş nötrofillerde reseptör seviyelerinin membran nicelleştirilmesinin zor olduğunu belirtmek gerekir (aşağıya bakınız). Son olarak, bu protokolün olası bir uzantısının, daha ayrıntılı lokalizasyon analizleri için canlı görüntülemeyi immünohistokimya ile takip etmek olacağını not ediyoruz.
Tol2 transgenez sistemi iyi kurulmuş7'dir ve lizozim C promotörü nötrofil ekspresyonu11,15 için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, transgenez yaklaşımı nispeten basittir ve bu promotör ile elde edilen ekspresyon seviyesi, reseptör dinamiklerinin analizi için yeterli kontrast sağlayacak kadar yüksektir. Olası bir sınırlama, ekspresyon seviyesinin endojen reseptör ekspresyon seviyelerini özetlememesidir. Yeni CRISPR teknolojileri, özellikle ilgi çekici reseptörler için zincirleme hatlar oluşturmak üzere konuşlandırılabilir28. Bu teknolojiler hala hantaldır ve hücre altı görüntüleme için gerekli ekspresyon seviyelerini garanti etmeyebilir, ancak başarılı gelişimleri endojen sinyal dinamiklerini anlamak için önemli bir atılım olacaktır. Fonksiyonel doğrulamalar, transgenik reseptör yapıları ile verilerin yorumlanması için önemlidir. Örneğin, floresan füzyon proteininin işlevsel olduğunu belirlemek için ligand tanıma testleri kullanılabilir ve transgenik nötrofil ekspresyon seviyelerinin işlevsellik14 ile uyumlu olduğunu belirlemek için nakavt fenotiplerinin kurtarılması kullanılabilir. Son olarak, reseptör füzyonunu doğrulamanın daha doğrudan bir yolu, etiketlenmemiş versiyonlar14'ün yanı sıra etiketli reseptörlü in vitro fonksiyonel bir tahlil kullanmak olacaktır.
Niceleme yaklaşımı, nötrofillerde in vivo olarak doğru membran segmentasyonundaki spesifik zorlukları ele almaktadır. Epitel niteliğindeki hücrelerde, membran reseptör seviyelerinin normalleştirilmesi, membran reseptör seviyelerinin bir kontrol belirtecine normalleştirilmesiyle otomatik olarak gerçekleştirilebilir, bu da tandem veya ayrı ayrı ifade edilebilir9. Gerçekten de, gastrulating embriyolarında ligand tanıma testini kullanırken böyle bir yaklaşım uyguladık14. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo hücre şeklinde karmaşık, hızlı değişikliklere uğrar ve membran segmentasyonunu hem 2D hem de 3D14'te zorlaştırır. Bu, birçok fizyolojik ortamda meydana gelen nötrofiller kümelendiğinde daha da zordur29. Kontrast metrik, membran segmentasyonu gerektirmediği, bunun yerine hücredeki reseptör dağılımının genel durumunu yansıttığı için bu sınırlamanın üstesinden gelir (membranöz / pürüzsüz vs veziküler / noktalı). Kontrast metriğinin görüntünün genel kontrastından etkilenebileceğine dikkat etmek önemlidir, bu nedenle farklı embriyolarda / örneklerde sinyalin değişkenliğini hesaba katmak için bireysel hücre değerlerinin dahili bir referansa normalleştirilmesi gerekir. Örneğin, CHT'deki yanıt vermeyen nötrofillerin ortalama hücre kontrast değerini kullandık (yani, sabit kalan ve ventral yüzgecine göç etmeyen nötrofiller)14. Ek bir olasılık, aynı hücredeki bir kontrol işaretçisinin kontrast değerleriyle normalleştirmek olacaktır. Bu, yanıt vermeyen hücrelerin dahili bir referansı mevcut olmadığında bir çözüm sağlayacaktır ve muhtemelen farklı koşullar arasındaki reseptör dinamiklerindeki daha ince nicel farklılıkları çözebilir.
Görüntülemenin yeri dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Burada ventral yüzgeç yarasının seçilmesinin nedeni, daha yaygın olarak kullanılan kuyruk yüzgeci yara modeli16,30'un aksine, yaralama yerinin nötrofil ikametgahı / göçmen kökenli bölgeye yakın olmasıdır. Bu, nötrofillerin gelmesi nispeten az zaman aldığı için tahlilin zaman çizelgesini hızlandırır. Ek olarak, hem göç kaynağında (CHT) hem de ilgilenilen hedef konumda (yara) hücre davranışını yakalama fırsatı sağlar. Bu burada önemlidir, çünkü hücre altı görüntüleme için gereken uzamsal ve zamansal çözünürlüğün geniş bir görüş alanı veya çok konumlu tarama ile birleştirilmesi zordur. Bu nedenle, ventral yüzgeç yara testi, göç orijininden göç yanıtının evriminin izlenmesine ve yanıt vermeyen hücrelerdeki spesifik olmayan reseptör dalgalanmalarının eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi, ikincisi, spesifik olmayan dinamikler için dahili bir referans sağladığı için niceleme amaçları için yararlıdır. Diğer sistemlerde, böyle bir iç referansa sahip olmak mümkün olmayabilir, bu durumda birlikte ifade edilen bir membran işaretleyicisinin kontrast değerleri alternatif bir kontrol sağlayacaktır.
Özetle, metodolojinin diğer sistemlere uygulanabilir olduğunu ve çeşitli amaçlar için konuşlandırılabileceğini öngörüyoruz. Örneğin, aynı muhabirler enfeksiyon ayarları veya diğer hastalık modelleri gibi diğer enflamatuar ortamlarda kullanılabilir. Zebra balığı reseptör raporlayıcı hatlarının repertuarı, sinyal mekanizmalarını anlamak veya ligand dinamiklerini in vivo olarak bildirmek için diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir. Yaklaşım, gözlemlenen dinamiklerin mekanik temelini sorgulamak için nakavt / nakavt teknikleriyle birleştirilebilir. Örneğin, ligand ekspresyonunun pertürbasyonu, gözlemlenen reseptör dinamikleri için ligand bağımlılığını gösterebilir. Gelecekte, sistemin muhabirlerin zincirleme olarak yerleştirilmesini içerecek şekilde daha da rafine edilebileceğini öngörüyoruz. Nihayetinde, bu metodolojiyi kullanan bulgular, memelilerde bu sinyal reseptörlerinin korunması ve bu çalışmaların daha büyük organizmalarda yürütülmesinin göreceli zorluğu göz önüne alındığında, zebra balığı topluluğunun ötesinde değerli yeni bilgiler sağlayacaktır.

Lökosit göçü immün yanıtlar için büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık hücreleri, dokuları ve kan damarlarını geçebilen ve mikroplara veya diğer önemli konakçı hücrelere doğru yönlü olarak göç etmek için bir dizi kimyasal rehberlik ipucunu algılayabilen prototipik göçmen hücrelerdir. Doğru rehberlik, kemokinlerin en belirgin kategori1'i temsil ettiği kemoattractantların tanınmasına dayanır. Kemokinler, oldukça spesifik yedi transmembran G protein eşleşmiş reseptörleri tarafından tanınır. Kemokin bağlanması üzerine, kemokin reseptörleri, ilişkili trimerik G proteinlerinin aktivasyonuna ve bunların sitoiskelet değişikliklerini ve yönlendirilmiş migrasyonunu destekleyen fonksiyonel sinyal alt birimlerine ayrışmasına yol açan konformasyonu değiştirir1. İkincil olarak, kemokin reseptörleri fosforile edilir ve bu modifikasyon, cezbedici için duyarsızlaştırmaya yol açar, bunu hızlı yeniden duyarlılaştırma / geri dönüşüm veya hücre içi bozunma ve hücre yüzeyinden aşağı regülasyonizleyebilir 2. Bu reseptör dinamikleri, hücreler tarafından alınan sinyallemenin süresini ve dozunu etkiler, ancak lökosit migrasyon davranışını nasıl etkilediklerini in vivo olarak aydınlatmak zor olmuştur.
Geleneksel memeli sistemlerinde canlı lökositlerdeki reseptör dinamiklerinin izlenmesi çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Canlı çalışmalar için, floresan proteinlerle reseptör füzyonları hücrelerde eksprese edilmelidir. Bu, birincil lökositlerde, özellikle nötrofillerde zordur ve şimdiye kadar yapılan çalışmalar, kemokin reseptörlerini 3,4 eksprese etmek için vekil nötrofil hücre hatlarını kullanmıştır. Lökositlerin bilgilendirici kaçakçılık kusurları5,6 olan bir floresan reseptörü veya mutant reseptörleri eksprese ettiği transgenik fare modellerinin oluşturulması, önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı gerektirir. Bu durumlarda bile, canlı hayvanda görüntüleme reseptör dinamikleri için görüntüleme çözünürlüğü ve kontrastı sınırlı olabilir ve çalışmalar sabit doku kesitleri5'te immünohistokimyayı kullanmıştır. Bu teknik zorluklar göz önüne alındığında, kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı bir doku ortamında hücre davranışını nasıl etkilediğine dair anlayışımız şu anda sınırlıdır.
Burada, zebra balığı nötrofillerinde reseptör kaçakçılığını izlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Zebra balığı, fareler gibi genetik olarak izlenebilir, ancak transgenez, verimli transpozon sistemleri ve doğrudan zigot manipülasyonu7 kullanılarak nispeten daha basittir. Şeffaf larva ideal olarak görüntülemeye uygundur. Kemokin reseptör dinamikleri, primordiyan germ hücrelerinde ve lateral line primordiumda, floresan muhabirler 8,9,10 ile karşılık gelen füzyonların ekspresyonu ile görselleştirilmiştir. Zebra balığı larvaları, memeli nötrofillerine göre oldukça korunmuş genetik ve hücresel özelliklere sahip olgun nötrofiller ile donatılmıştır. Sitoiskelet dinamiği ve polarite düzenleyicileri gibi hücre altı sinyal dinamikleri, bu hücrelerde karşılık gelen transgenik çizgilerin üretilmesiyle görselleştirilmiştir11,12,13. Son zamanlarda, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerdeki kemokin reseptör dinamiklerini görselleştirdik ve fonksiyonel olarak analiz ettik14. Burada, nötrofillerde kemokin sinyalizasyonu için transgenik muhabir hatlarının üretimini, canlı görüntüleme için embriyoların hazırlanmasını, nötrofil sinyallemesini incelemek için bir yara tahlili ve görüntülerin elde edilmesi ve analizi için protokolü açıklıyoruz. Ayrıca, aday ligandlara kemokin reseptör yanıtlarını test etmek için bir yan protokol sağlıyoruz, bu da karakterize edilmemiş reseptörlerde ligand tanıma paternleri oluşturmaya çalışırken yararlıdır. Bu teknikler, endojen kemokin ekspresyonunun inhibisyonu veya değiştirilmiş ligand kaynaklı kaçakçılık ile mutant reseptörlerin üretilmesi gibi daha ileri genetik manipülasyonlarla kombinasyon halinde, spesifik sinyal dinamiklerinin lökosit davranışını in vivo olarak nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilir. Floresan etiketli kemokin reseptörlerini ifade eden transgenik çizgiler, doğrudan antikor boyama ile tespit edilmesi zor olan endojen kemokin gradyanları için muhabir olarak da kullanılabilir. Açıklanan metodoloji, muhabirlerin üretimini diğer immüno-sinyal reseptörlerine genişletmek için kapsam sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Kimyasal gradyanlar tarafından lökosit rehberliği, immün yanıtlar için gereklidir. Nötrofiller, önemli antimikrobiyal işlevleri yerine getirdikleri doku hasarı bölgelerine alınan ilk hücrelerdir. Bu lokuslara yapılan kaçakçılık, kemokinler de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar kemoattractantlar tarafından düzenlenmektedir. Moleküler düzeyde, kemoattractant sinyalleme, karşılık gelen reseptörlerin hücre içi trafiği ile düzenlenir. Bununla birlikte, kemokin reseptörlerindeki hücre altı değişikliklerin hücre ve doku düzeyinde lökosit migrasyon dinamiklerini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Burada, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerde kemokin reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu araçlar, zebra balığı nötrofillerinde diferansiyel kemokin reseptörü kaçakçılığının, doku hasarı bölgelerinde nötrofil kümelenmesini ve dağılmasını koordine ettiğini ortaya koymuştur. Bunun, enflamatuar yanıtların kendi kendine nasıl çözüldüğünü anlamamız için etkileri vardır. Tarif edilen araçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda nötrofil göç paternlerini anlamak için kullanılabilir ve metodoloji diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir.

Ventral yüzgeç yaralanmasını KHT'den ventral yüzgece hızlı nötrofil mobilizasyonu ve 30-60 dakika içinde yara kenarında kümelenme izler (Şekil 1). Zebra balığı nötrofilleri 24 tarafından eksprese edilen ve eğirme diski konfokal mikroskopisi kullanarak Cxcl8a ve Cxcl8b14'ü tanıyan iki kemokin reseptörünün, Cxcr1 ve Cxcr2'nin dağılımını görselleştirdik. Nötrofillerin reseptörün floresan zamanlayıcı (FT) yapısını ifade ettiği, yani sfGFP ve tagRFP tandemiyle bir füzyon olan Tg (lyz: Cxcr1-FT) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) olmak üzere iki karşılık gelen transgenik çizgi ürettik (Şekil 2 ve referans14). İki floroforun kullanımı, çok çeşitli reseptör kaderlerinin izlenmesine izin vermek ve plazma zarında protein devir süresi tahminleri sağlamak için tasarlandı, çünkü yeni sentezlenen reseptörler yeşil renkte floresan olacak ve 8,14 yaşlarında giderek kırmızı hale gelecektir. Bununla birlikte, bu reseptörlerin nötrofil plazma membranında hızlı kurucu ciroya sahip olduğu ve ikamet süresinin tagRFP'nin olgunlaşma süresinden daha kısa olduğu, sfGFP'nin membran lokalizasyonunu gösterdiği ve tagRFP'nin kararlı durumda veziküler lokalizasyonu gösterdiği bulunmuştur (Ek Video 1 ve ref14). Bu nedenle, doku hasarı bölgelerinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi izlemek için sfGFP'nin dağılımına odaklandık. Reseptör dağılımının paterni, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü. Gerekçe, reseptör dağılımı membranöz ve pürüzsüz olduğunda, kontrast değerinin düşük olmasıdır. Reseptör dağılımı veziküler ve daha fazla noktasal olduğunda, kontrast değeri yüksektir (Şekil 3).
Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin (sfGFP yoğunluğu) bir kontrol membranı belirtecinin seviyelerine oranını ölçmektir, örneğin membran CFP (mCFP) (Şekil 3). Her iki yöntem de, hücrede küresel olarak daha fazla veziküler reseptör dağılım paterni (daha yüksek kontrast değeri) veya membrandaki daha düşük reseptör seviyeleri (daha düşük sfGFP / mCFP oranı) ile belirtildiği gibi reseptör içselleştirmesini tespit edebilir. Bununla birlikte, kontrast metriği, membran segmentasyonunun daha az doğru olduğu ve uygulanamadığı yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini de tespit edebilir (Şekil 3). Bu metriği kullanarak, yaralardaki nötrofillerde Cxcr1 ve Cxcr2 kaçakçılığı arasındaki gözle görülür farklılıkları ölçebildik (Şekil 4 ve Ek Video 2). Cxcr1-FT yarada bulunan hücrelerde içselleştirilirken, Cxcr2-FT yaradaki nötrofillerde membranöz kalmıştır (Şekil 4A-C, Ek Video 2 ve Ek Video 3). Morfolino tedavisi ile Cxcl8a ve Cxcl8b'nin baskılanması, yaralarda Cxcr1-FT içselleştirmesini farklı şekilde etkilemiştir (Şekil 4C,D). Cxcr1-FT'nin Cxcl8a'ya yanıt verdiğini daha da doğrulamak için, erken embriyolarda kemokin yanıt testleri yaptık. Cxcr1-FT'nin, Cxcl8a'nın birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirildiğini bulduk(Şekil 5). Tüm bu sonuçlar, nötrofillerde kemokin kaynaklı reseptör içselleştirmesini ölçmek ve bu etkilere aracılık eden ligandın kimliğini belirlemek için tarif edilen yöntemlerin uygulanabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Şekil 1: Ventral yüzgeç yaralarına nötrofil göçü. (A) (Solda) Kaudal hematopoetik dokunun (CHT), venüs dolaşımının (VC, mavi), ventral yüzgecin (VF) ve yara yerinin yerini gösteren 3 dpf larva karikatürü. (Sağda) Nötrofillerin CHT'den harekete geçirilmesi ve yarada kümelenmesiyle yaranın (W) alanını gösteren karikatür. CHT dokusunun kaudal ven pleksusu (CVP) mavi renkte çizilir. (B) Ventral yüzgeç yarasını ve Tg (mpx: GFP) larvalarındaki nötrofillerin dağılımını gösteren parlak alan görüntüsü (solda) ve konfokal projeksiyon (sağda) yaralama sonrası 2 saatte. Kesikli çizgiler VF ve CHT anahatlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiş karikatür ve floresan görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Şekil 2: Nötrofillerde kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi. (A) Cxcr1-FT (Floresan Zamanlayıcı) ve Cxcr2-FT'nin nötrofil-spesifik transgenik ekspresyonu için kullanılan yapılar 3 dpf transgenik larva (Tg(lyz:Cxcr1-FT), üstteki nötrofillerin konfokal projeksiyonları; Tg (lyz:Cxcr2-FT), alt) tRFP (macenta) ve sfGFP (yeşil) kanallarını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Şekil 1A'daki gibi 3 dpf larvanın anatomik şeması. Larvaların altında, yaranın (W) alanını gösteren şemalar, nötrofillerin CHT'den (üstte) mobilize edilmesi veya ventral yüzgece (alt) girdikten sonra kemotaksis yapılması ile tasvir edilir. Kesikli kare, sağdaki anlık görüntülerde görüntülenen alanı gösterir. (C) Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvalarındaki nötrofiller (sfGFP gösterilmiştir) CHT'den (üst paneller) veya kemotaksisten yaraya (alt paneller) doğru mobilizasyon üzerine. Oklar zaman içinde aynı hücreleri gösterir. Sağdaki görüntüdeki zaman noktaları, soldaki görüntüden sonra geçen dakikalardır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi için deneysel yaklaşımın şematik gösterimi. Paneller A-C ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Şekil 3: Reseptör dinamiklerinin nicelleştirme örnekleri. Yaralardaki tek (mavi) veya kümelenmiş nötrofiller (yeşil) veya CHT'deki (kırmızı, turuncu) mobilize edilmemiş nötrofiller, sonuçları karşılaştırmak için farklı yöntemlerle bölümlere ayrıldı ve analiz edildi. Gösterilen aynı örnek hücreler, görüntüde görülenleri çıkarılan değer aralığıyla ilişkilendirmek için iki yöntemle analiz edilmiştir. (A) Seçilen, örnek hücrelerin yüzeyi, sfGFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. (B) Kontrast, A'da gösterilen örnek hücrelerden hesaplandı. (C) Seçilen, örnek hücrelerin zarı, CFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. Bunu sfGFP/CFP'nin oranmetrik analizi izledi. (D) SfGFP / CFP oranı, C'de gösterilen örnek hücreler üzerinde hesaplanmıştır. hata çubukları, tek tek hücrelerden S.E.M.'yi temsil eder, n>1 durumunda, buradaki değerler istatistiksel analiz için değil, yalnızca farklı niceleme yöntemleriyle elde edilen ölçümleri örneklemek için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Şekil 4: Yaralanmaya yanıt olarak Cxcr1 ve Cxcr2'nin diferansiyel dinamikleri. (A) Tg(lyz:Cxcr1-FT) veya Tg(lyz:Cxcr2-FT) larvalarındaki nötrofillerin yara sonrası 80 dakikada konfokal projeksiyonu (sfGFP kanalı gösterilmiştir). Ölçek çubuğu = 10 μm.  (B) Yarada büyütülmüş Cxcr1-FT nötrofil (solda) ve Cxcr2-FT (sağda). Yeşil reseptör gri renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Normalleştirilmiş kontrast (CHT'deki mobilize edilmemiş hücrelerin ortalama kontrastına normalleştirilmiş bireysel nötrofil başına kontrast). cxcl8a, cxcl8a için çeviri bloke edici bir morfolino ile birlikte bir ekleme blokajının enjeksiyonunu ifade eder. cxcl8b, cxcl8b için ekleme bloke edici bir morfolino ile enjeksiyonu ifade eder. Tg (lyz: Cxcr1-FT için: n = 24 hücre (CHT), n = 8 larvadan 47 hücre (yara). Morfolinolu Tg (lyz: Cxcr1-FT) için: 5 larvadan n = 28 hücre (Cxcl8a-MO), 5 larvadan n = 16 hücre (Cxcl8b-MO). Tg (lyz: Cxcr2-FT için): n = 10 hücre (CHT) ve n = 20 hücre (yara) 3 larvadan. Veriler 1-5 görüntüleme seansında elde edilen bağımsız larvalardan toplandı. Kruskal-Wallis, Dunn'ın Tg (lyz: Cxcr1-FT) için çoklu karşılaştırma testi, Tg (lyz: Cxcr2-FT) için iki kuyruklu eşleşmemiş Mann-Whitney testi ile test edildi. (D) Cxcl8a morfolinosu (MO) (solda) ve cxcl8b MO (sağda) ile tedavi edilen Tg (lyz: Cxcr1-FT) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına (yeşil renkte gösterilen sfGFP kanalı) yanıt veren nötrofillerin konfokal projeksiyonu. Eşdeğer nötrofil birikiminin zaman noktalarında çekilen anlık görüntü (sol görüntüde 85 dakika yaralama sonrası ve sağ görüntüde 45 dakika yaralama sonrası). Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Şekil 5: Erken embriyolarda kemokin yanıt testi. Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA'nın ekspresyonunu ve dağılımını gösteren gastrulating embriyolarının lazer taramalı konfokal dilimleri, 150 pg Cxcl8a mRNA'lı veya Cxcl8a mRNA'sız bir hücre aşaması yumurtasına enjekte edildi. Yeşil ve kırmızı reseptörler ayrı kanallarda gösterilir. Kontrol membranı CFP işaretleyicisi (mCFP) camgöbeği kanalında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Film 1: 3 dpf'de bir Tg (lyz: Cxcr1-FT) (solda) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) (sağda) larvalarının kafasındaki transgenik nötrofiller. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 5 fps'dir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT) (solda) ve Tg(lyz:Cxcr2-FT) (sağda) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına yanıt veren nötrofiller. Film yaralama sonrası 10 dakika içinde başlar ve 60 dakika sürer. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 10 fps'dir. CHT = kaudal hematopoetik doku. VF = ventral yüzgeç. Ölçek çubuğu = 25 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 3. Yaralı bir Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgenik larvadan (Video 2'de gösterilenden farklı larva) nötrofillerin ek örnekleri, daha yüksek çözünürlükte elde edilir, CHT'de mobilizasyon üzerine veya girişte reseptör içselleşmesini (yeşil renkle gösterilen sfGFP kanalı) gösterir ve ventral yüzgeçte kemotaksis. Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 2 fps'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Görüntüleme.  University of Cambridge. Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Video: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.