Wir danken Christine Holt und Bill Harris für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken Darren Gilmour für die fluoreszierenden Timer-Backbone-Konstrukte und Anna Huttenlocher für den Tol2-Lyz-Backbone-Vektor. Wir danken Steve Renshaw für die Tg(mpx:GFP)i114 Linie. Diese Arbeit wurde vom MRC (MR/L019523/1), dem Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] und ein Isaac Newton Trust Grant 19.23(n). C.C. wurde von einem MRC DTP-Stipendium und teilweise vom Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] gewähren. H.W. wurde von einem MRC DTP Studentship unterstützt. H.P. wurde durch ein Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) und teilweise durch einen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] Grant und das MRC (MR/L019523/1).

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt

Die beschriebene Methode ermöglicht eine Live-Bildgebung der Rezeptordynamik als Reaktion auf endogene Liganden in situ während einer Entzündungsreaktion auf Gewebeschäden. Die Verwendung von Cxcr1/Cxcr2-Neutrophilenreportern könnte auf andere physiologische Umgebungen wie Infektionen, Tumormodelle oder andere Arten von Gewebeschädenausgeweitet werden 14,25,26,27. Darüber hinaus könnten transgene Rettungslinien, bei denen der endogene Rezeptor von einem exogenen mutierten Rezeptor unterdrückt und gerettet wird, nützliche Werkzeuge liefern, um die Bedeutung spezifischer neutrophiler Migrationsmuster bei Immunantworten zu analysieren. Zum Beispiel verursachen Cxcr1-Rezeptor-Mutanten, die eine gestörte Desensibilisierung haben, eine prominentere Neutrophilen-Clusterbildung an Entzündungsstellen14. Dieser Funktionsgewinn-Phänotyp könnte verwendet werden, um die Rolle der Neutrophilenansammlung in verschiedenen physiologischen Prozessen zu verstehen, z. B. Wundreparatur, Infektionskrankheiten oder Tumorevolution, und Rezeptor-Knockdown- / Knockout-Experimente zu ergänzen. Die Methodik bietet auch eine Grundlage, um das Spektrum der verfügbaren Reporter zu erweitern. Die Wahl des fluoreszierenden Reporters ist wichtig zu berücksichtigen und hängt von der biologischen Frage ab. Wir fanden heraus, dass der konstitutive Umsatz dieser Chemokinrezeptoren in Neutrophilen im Vergleich zu Epithelzellen hoch warund dass Reporter mit schneller Reifung (z. B. sfGFP) verpflichtet waren, Membranspiegel im stationären Zustand zu melden und Unterschiede bei Neutrophilenstimulation aufzulösen 8,14. Daher sind Membranverhältnisse von sfGFP / tagRFP nicht anwendbar, um die ligandeninduzierte Internalisierung in diesem Zelltyp zu messen, aber das Muster von tagRFP ermöglicht die Verfolgung der intrazellulären Schicksale des Rezeptors, was in einigen Studien nützlich sein könnte. Wir fanden auch heraus, dass das konzentriertere intrazelluläre Signal von tagRFP für das Screening einzelner Larven nützlich ist. Ein alternativer Ansatz zur Messung der Rezeptorspiegel an der Plasmamembran wäre die Co-Expression eines fluoreszierenden Membranmarkers in Neutrophilen entweder im selben Transgen9 oder in einem unabhängigen Transgen14. Im ersten Szenario würde das Transgen ein zusätzliches Mittel für das Screening der Fische darstellen und die Expressionsniveaus wären zwischen dem Marker und dem Rezeptor vergleichbar. Der letztere Ansatz wäre modularer, da eine Zebrafischlinie mit einem Rezeptorreporter mit verschiedenen Reporterlinien kombiniert werden könnte. In beiden Fällen ist es erwähnenswert, dass die Membranquantifizierung der Rezeptorspiegel bei geclusterten Neutrophilen eine Herausforderung darstellt (siehe unten). Schließlich stellen wir fest, dass eine mögliche Erweiterung dieses Protokolls darin bestehen würde, die Live-Bildgebung durch Immunhistochemie für detailliertere Lokalisierungsanalysen zu verfolgen.
Das Tol2-Transgenesesystem ist gut etabliert7 und der Lysozym-C-Promotor wurde ausgiebig für die neutrophile Expression11,15 verwendet. Der Transgeneseansatz ist daher relativ einfach und das mit diesem Promotor erreichte Expressionsniveau ist hoch genug, um einen ausreichenden Kontrast für die Analyse der Rezeptordynamik zu bieten. Eine mögliche Einschränkung besteht darin, dass das Expressionsniveau nicht die endogenen Rezeptorexpressionsniveaus rekapituliert. Neue CRISPR-Technologien könnten eingesetzt werden, um Knock-in-Leitungen für Rezeptoren von besonderem Interessezu etablieren 28. Diese Technologien sind immer noch umständlich und garantieren möglicherweise nicht die erforderlichen Expressionsniveaus für die subzelluläre Bildgebung, aber ihre erfolgreiche Entwicklung wäre ein wichtiger Durchbruch für das Verständnis der endogenen Signaldynamik. Funktionelle Validierungen sind wichtig, um Daten mit transgenen Rezeptorkonstrukten zu interpretieren. Zum Beispiel können Ligandenerkennungsassays verwendet werden, um festzustellen, dass das fluoreszierende Fusionsprotein funktionell ist, und die Rettung von Knockout-Phänotypen könnte verwendet werden, um festzustellen, ob die transgenen neutrophilen Expressionsniveaus mit der Funktionalitätkompatibel sind 14. Schließlich wäre eine direktere Möglichkeit, die Rezeptorfusion zu validieren, die Verwendung eines in vitro funktionellen Assays mit markiertem Rezeptor neben nicht markierten Versionen14.
Der Quantifizierungsansatz adressiert spezifische Schwierigkeiten bei der genauen Membransegmentierung in Neutrophilen in vivo. In Zellen epithelialer Natur kann die Quantifizierung der Rezeptorspiegel automatisch durchgeführt werden, indem die Membranrezeptorspiegel auf einen Kontrollmarker normalisiert werden, der im Tandem oder separat ausgedrückt werden kann9. In der Tat haben wir einen solchen Ansatz angewandt, als wir den Ligandenerkennungsassay bei gastrulierenden Embryonen14 verwendeten. Neutrophile durchlaufen jedoch in vivo komplexe, schnelle Veränderungen der Zellform, was die Membransegmentierung sowohl in 2D als auch in 3Derschwert 14. Dies ist noch schwieriger, wenn sich Neutrophile häufen, was in vielen physiologischen Umgebungen vorkommt29. Die Kontrastmetrik überwindet diese Einschränkung, da sie keine Membransegmentierung erfordert, sondern den Gesamtzustand der Rezeptorverteilung in der Zelle widerspiegelt (membranös / glatt vs. vesikulär / punktförmig). Es ist wichtig zu beachten, dass die Kontrastmetrik durch den Gesamtkontrast des Bildes beeinflusst werden kann, so dass eine Normalisierung einzelner Zellwerte auf eine interne Referenz erforderlich ist, um die Variabilität des Signals in verschiedenen Embryonen / Proben zu berücksichtigen. Zum Beispiel verwendeten wir den mittleren Zellkontrastwert von nicht reagierenden Neutrophilen in der CHT (d.h. Neutrophilen, die stationär bleiben und nicht in die Bauchflosse wandern)14. Eine zusätzliche Möglichkeit wäre, mit Kontrastwerten eines Kontrollmarkers in derselben Zelle zu normalisieren. Dies würde eine Lösung bieten, wenn keine interne Referenz von nicht reagierenden Zellen verfügbar ist, und könnte wahrscheinlich feinere quantitative Unterschiede in der Rezeptordynamik zwischen verschiedenen Bedingungen auflösen.
Der Speicherort der Bildgebung ist eine weitere zu berücksichtigende Variable. Der Grund für die Wahl der Bauchflossenwunde hier, im Gegensatz zu der häufiger verwendeten Heckflossenwunde Modell16,30, ist, dass der Ort der Verwundung in der Nähe des Ortes des neutrophilen Wohnsitzes / Migrationsursprungs liegt. Dies beschleunigt die Zeitleiste des Assays, da es relativ wenig Zeit braucht, bis Neutrophile ankommen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, das Zellverhalten sowohl am Migrationsursprung (CHT) als auch am Zielort von Interesse (Wunde) zu erfassen. Dies ist hier relevant, da die räumliche und zeitliche Auflösung, die für die subzelluläre Bildgebung erforderlich ist, schwer mit einem großen Sichtfeld oder Multipositions-Scanning zu kombinieren ist. So erlaubt der ventrale Flossenwundassay die Verfolgung der Entwicklung der Migrationsreaktion vom Migrationsursprung und die gleichzeitige Erfassung unspezifischer Rezeptorschwankungen in Zellen, die nicht reagieren. Wie bereits erwähnt, ist letzteres für Quantifizierungszwecke nützlich, da es eine interne Referenz für unspezifische Dynamiken bietet. In anderen Systemen ist es möglicherweise nicht möglich, eine solche interne Referenz zu haben, in diesem Fall würden die Kontrastwerte eines co-exprimierten Membranmarkers eine alternative Kontrolle bieten.
Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Methodik auf andere Systeme anwendbar ist und für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt werden kann. Zum Beispiel könnten die gleichen Reporter in anderen entzündlichen Umgebungen wie Infektionseinstellungen oder anderen Krankheitsmodellen eingesetzt werden. Das Repertoire der Zebrafischrezeptor-Reporterlinien könnte auf andere Signalrezeptoren erweitert werden, um Signalmechanismen zu verstehen oder die Ligandendynamik in vivo zu melden. Der Ansatz kann mit Knockdown/Knockout-Techniken kombiniert werden, um die mechanistischen Grundlagen der beobachteten Dynamik zu hinterfragen. Zum Beispiel kann eine Störung der Ligandenexpression die Ligandenabhängigkeit für die beobachtete Rezeptordynamik anzeigen. In Zukunft stellen wir uns vor, dass das System weiter verfeinert werden könnte, um die Knock-in-Einfügung von Reportern zu integrieren. Letztendlich würden Ergebnisse, die diese Methodik verwenden, neue Erkenntnisse liefern, die über die Zebrafischgemeinschaft hinaus wertvoll sind, angesichts der Erhaltung dieser Signalrezeptoren bei Säugetieren und der relativen Herausforderung, diese Studien in größeren Organismen durchzuführen.

Die Leukozytenmigration ist von größter Bedeutung für die Immunantwort. Immunzellen sind prototypische wandernde Zellen, die bemerkenswert in der Lage sind, Gewebe und Blutgefäße zu durchqueren und eine Reihe von chemischen Führungshinweisen zu erfassen, um in Richtung Mikroben oder andere wichtige Wirtszellen zu wandern. Die korrekte Führung beruht auf der Erkennung von Chemolockstoffen, unter denen Chemokine die prominenteste Kategorie1 darstellen. Chemokine werden von hochspezifischen sieben-transmembranigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren erkannt. Bei der Chemokinbindung ändern Chemokinrezeptoren die Konformation, was zur Aktivierung assoziierter trimeraler G-Proteine und deren Dissoziation in funktionelle Signaluntereinheiten führt, die zytoskelettale Veränderungen und gerichtete Migration fördern1. Sekundär werden Chemokinrezeptoren phosphoryliert, und diese Modifikation führt zu einer Desensibilisierung des Lockstoffs, der eine schnelle Resensibilisierung / Recycling oder intrazellulärer Abbau und Herunterregulierung von der Zelloberfläche folgenkann 2. Diese Rezeptordynamik beeinflusst die Dauer und Dosis der Signalübertragung, die von den Zellen empfangen wird, aber wie sie das Migrationsverhalten der Leukozyten beeinflussen, war in vivo schwer zu erklären.
Die Verfolgung der Rezeptordynamik in lebenden Leukozyten in traditionellen Säugetiersystemen steht vor mehreren Herausforderungen. Für Lebendstudien müssen Rezeptorfusionen mit fluoreszierenden Proteinen in den Zellen exprimiert werden. Dies ist in primären Leukozyten, insbesondere bei Neutrophilen, eine Herausforderung, und Studien haben bisher Surrogat-Neutrophilen-Zelllinien verwendet, um Chemokinrezeptorenzu exprimieren 3,4. Die Generierung transgener Mausmodelle, in denen Leukozyten einen fluoreszierenden Rezeptor oder mutierte Rezeptoren mit informativen Trafficking-Defekten5,6 exprimieren, ist mit einem erheblichen Zeit- und Ressourcenaufwand verbunden. Selbst in diesen Fällen können die Bildgebungsauflösung und der Kontrast für die bildgebende Rezeptordynamik im lebenden Tier begrenzt sein, und Studien haben Immunhistochemie an fixierten Gewebeabschnitten5 verwendet. Angesichts dieser technischen Herausforderungen ist unser Verständnis darüber, wie die Dynamik von Chemoattraktorrezeptoren das Zellverhalten in einem lebenden Gewebe beeinflusst, derzeit begrenzt.
Hier stellen wir eine Methodik zur Überwachung des Rezeptorhandels in Zebrafisch-Neutrophilen vor. Zebrafische sind genetisch behandelbar, wie Mäuse, aber die Transgenese ist durch den Einsatz effizienter Transposonsysteme und direkter Zygotenmanipulation relativ einfach7. Die transparente Larve ist ideal bildgebend. Die Dynamik des Chemokinrezeptors wurde in primordialen Keimzellen und der Laterallinie Primordium durch Expression entsprechender Fusionen mit fluoreszierenden Reporternvisualisiert 8,9,10. Zebrafischlarven sind mit reifen Neutrophilen ausgestattet, die hochgradig konservierte genetische und zelluläre Eigenschaften in Bezug auf Neutrophile von Säugetieren aufweisen. Subzelluläre Signaldynamiken wie zytoskelettale Dynamik und Polaritätsregulatoren wurden in diesen Zellen durch die Erzeugung entsprechender transgener Linien11,12,13 visualisiert. Kürzlich haben wir die Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen im Verlauf von Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden visualisiert und funktionell analysiert14. Hier beschreiben wir die Erzeugung transgener Reporterlinien für die Chemokinsignalisierung in Neutrophilen, die Vorbereitung von Embryonen für die Live-Bildgebung, einen Wundassay zur Untersuchung der Neutrophilensignalisierung und das Protokoll für die Aufnahme und Analyse von Bildern. Wir bieten auch ein Nebenprotokoll zum Testen von Chemokinrezeptorreaktionen auf Kandidatenliganden, was nützlich ist, wenn versucht wird, Ligandenerkennungsmuster in nicht charakterisierten Rezeptoren zu etablieren. Diese Techniken können in Kombination mit weiteren genetischen Manipulationen, wie der Hemmung der endogenen Chemokinexpression oder der Erzeugung mutierter Rezeptoren mit verändertem Liganden-induziertem Trafficking, verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich spezifische Signaldynamiken auf das Verhalten von Leukozyten in vivo auswirken. Die transgenen Linien, die fluoreszierend markierte Chemokinrezeptoren exprimieren, können auch als Reporter für endogene Chemokingradienten verwendet werden, die sonst durch direkte Antikörperfärbung schwer nachzuweisen sind. Die beschriebene Methodik bietet Spielraum für die Ausweitung der Erzeugung von Reportern auf andere Immunsignalrezeptoren.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukozytenführung durch chemische Gradienten ist essentiell für Immunantworten. Neutrophile sind die ersten Zellen, die an Stellen von Gewebeschäden rekrutiert werden, wo sie entscheidende antimikrobielle Funktionen ausführen. Ihr Handel zu diesen Loci wird durch mehrere entzündliche Chemoattraktantien, einschließlich Chemokine, orchestriert. Auf molekularer Ebene wird die Chemoattraktus-Signalgebung durch den intrazellulären Transport der entsprechenden Rezeptoren reguliert. Es bleibt jedoch unklar, wie subzelluläre Veränderungen in Chemokinrezeptoren die Migrationsdynamik von Leukozyten auf Zell- und Gewebeebene beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Live-Bildgebung und quantitative Analyse der Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen während Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden. Diese Werkzeuge haben gezeigt, dass der differentielle Chemokinrezeptor-Verkehr in Zebrafisch-Neutrophilen die Neutrophilen-Clusterbildung und -Ausbreitung an Orten der Gewebeschädigung koordiniert. Dies hat Auswirkungen auf unser Verständnis, wie Entzündungsreaktionen selbstgelöst werden. Die beschriebenen Werkzeuge könnten verwendet werden, um neutrophile Migrationsmuster in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Umgebungen zu verstehen, und die Methodik könnte auf andere Signalrezeptoren ausgeweitet werden.

Auf die ventrale Flossenverwundung folgt eine schnelle Neutrophilenmobilisierung von der CHT in die Bauchflosse und eine Häufung am Wundrand innerhalb von 30-60 Minuten (Abbildung 1). Wir haben die Verteilung von zwei Chemokinrezeptoren, Cxcr1 und Cxcr2, visualisiert, die von Zebrafisch-Neutrophilen24 exprimiert werden und Cxcl8a und Cxcl8b14 mittels konfokaler Mikroskopie erkennen. Wir erzeugten zwei entsprechende transgene Linien, Tg(lyz:Cxcr1-FT) und Tg(lyz:Cxcr2-FT), in denen Neutrophile ein fluoreszierendes Timer-Konstrukt (FT) des Rezeptors exprimieren, d.h. eine Fusion mit einem Tandem aus sfGFP und tagRFP (Abbildung 2 und Referenz14). Die Verwendung der beiden Fluorophore sollte die Überwachung eines breiten Spektrums von Rezeptorschicksalen ermöglichen und Schätzungen der Proteinumsatzzeit an der Plasmamembran liefern, da neu synthetisierte Rezeptoren im Alter von 8,14 Jahren grün fluoreszieren und allmählich rot werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Rezeptoren einen schnellen konstitutiven Umsatz an der neutrophilen Plasmamembran aufweisen und dass die Verweilzeit kürzer war als die Reifezeit von tagRFP, wobei sfGFP eine Membranlokalisation und tagRFP eine vesikuläre Lokalisation im stationären Zustand zeigte (Ergänzendes Video 1 und Referenz14). Daher konzentrierten wir uns auf die Verteilung von sfGFP, um die ligandeninduzierte Internalisierung an Stellen von Gewebeschäden zu überwachen. Das Muster der Rezeptorverteilung wurde mit der Kontrastmetrik quantifiziert, die Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln meldet. Die Begründung ist, dass, wenn die Rezeptorverteilung membranös und glatt ist, der Kontrastwert niedrig ist. Wenn die Rezeptorverteilung vesikulär und punktförmiger ist, ist der Kontrastwert hoch (Abbildung 3).
Eine alternative Methode besteht darin, das Verhältnis von Rezeptorspiegeln (sfGFP-Intensität) zu den Spiegeln eines Kontrollmembranmarkers, z. B. Membran-CFP (mCFP), zu quantifizieren (Abbildung 3). Beide Methoden konnten die Rezeptorinternalisierung nachweisen, wie es durch ein stärkeres vesikuläres Rezeptorverteilungsmuster weltweit in der Zelle (höherer Kontrastwert) oder niedrigere Rezeptorspiegel an der Membran (niedrigeres sfGFP/mCFP-Verhältnis) angezeigt wird. Die Kontrastmetrik konnte jedoch auch die Rezeptorinternalisierung in Neutrophilenclustern an der Wunde nachweisen, in denen die Membransegmentierung weniger genau und nicht anwendbar war (Abbildung 3). Mit dieser Metrik konnten wir sichtbare Unterschiede zwischen dem Cxcr1- und Cxcr2-Handel mit Neutrophilen an Wunden quantifizieren (Abbildung 4 und ergänzendes Video 2). Cxcr1-FT internalisiert in Zellen an der Wunde, während Cxcr2-FT in Neutrophilen an der Wunde membranös blieb (Abbildung 4A-C, Supplementary Video 2 und Supplementary Video 3). Unterdrückung von Cxcl8a und Cxcl8b durch Morpholino-Behandlung, differentiell beeinflusste Cxcr1-FT-Internalisierung an Wunden (Abbildung 4C,D). Um weiter zu validieren, dass Cxcr1-FT auf Cxcl8a anspricht, führten wir Chemokin-Antwort-Assays in frühen Embryonen durch. Wir fanden heraus, dass Cxcr1-FT deutlich in Embryonen internalisiert wurde, in denen Cxcl8a co-exprimiert wurde (Abbildung 5). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die beschriebenen Methoden eingesetzt werden können, um die Chemokin-induzierte Rezeptorinternalisierung in Neutrophilen zu messen und die Identität des Liganden, der diese Effekte vermittelt, festzustellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Abbildung 1: Neutrophile Migration zu ventralen Flossenwunden. (A) (Links) Karikatur der 3 dpf-Larve, die die Lage des kaudalen hämatopoetischen Gewebes (CHT), der Venuszirkulation (VC, blau), der Bauchflosse (VF) und der Wundstelle zeigt. (Rechts) Karikatur, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellt, die von der CHT mobilisiert werden und sich an der Wunde gruppieren. Der Plexus caudalis cauda (CVP) des CHT-Gewebes ist blau gezeichnet. (B) Hellfeldbild (links) und konfokale Projektion (rechts), die die ventrale Flossenwunde und die Verteilung der Neutrophilen in Tg(mpx:GFP)-Larven bei 2 h nach der Wunde zeigt. Gestrichelte Linien zeigen VF- und CHT-Umrisse. Maßstabsleiste = 25 μm. Cartoon und fluoreszierendes Bild modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Abbildung 2: Live-Bildgebung des Handels von Chemokinrezeptoren in Neutrophilen. (A) Konstrukte, die für die neutrophilenspezifische transgene Expression von Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) und Cxcr2-FT verwendet werden. Konfokale Projektionen von Neutrophilen im Kopf einer 3 dpf transgenen Larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), oben; Tg(lyz:Cxcr2-FT), unten) mit tRFP (Magenta) und sfGFP (grün) Kanälen. Maßstabsleiste = 20 μm. (B) Anatomisches Schema von 3 dpf Larve wie in Abbildung 1A. Unterhalb der Larve befinden sich Schemata, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellen, die von der CHT (oben) mobilisiert werden oder beim Eintritt in die Bauchflosse (unten) Chemotaxis durchführen. Gestricheltes Quadrat zeigt den Bereich an, der in Schnappschüssen auf der rechten Seite abgebildet ist. (C) Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT)-Larven (sfGFP ist gezeigt) bei Mobilisierung von der CHT (obere Panels) oder Chemotaxis in Richtung der Wunde (untere Panels). Pfeile zeigen die gleichen Zellen im Laufe der Zeit. Zeitpunkte auf dem rechten Bild sind Minuten, die nach dem Bild auf der linken Seite verstrichen sind. Maßstabsstab = 10 μm. (D) Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes für die Live-Bildgebung des Chemokinrezeptor-Transports. Panels A-C modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierungsbeispiele der Rezeptordynamik. Einzelne (blaue) oder geclusterte Neutrophile (grün) an Wunden oder nicht mobilisierte Neutrophile in der CHT (rot, orange) wurden segmentiert und mit verschiedenen Methoden analysiert, um die Ergebnisse zu vergleichen. Die gleichen gezeigten Beispielzellen wurden mit zwei Methoden analysiert, um das, was im Bild zu sehen ist, mit dem extrahierten Wertebereich in Beziehung zu setzen. (A) Die Oberfläche der ausgewählten Beispielzellen wurde basierend auf der Konturdefinition im sfGFP-Kanal segmentiert. (B) Der Kontrast wurde aus den in A gezeigten Beispielzellen berechnet. (C) Die Membran der ausgewählten Beispielzellen wurde auf der Grundlage der Konturdefinition im CFP-Kanal segmentiert. Es folgte eine ratiometrische Analyse von sfGFP/CFP. (D) Das Verhältnis von sfGFP/CFP wurde an den in C gezeigten Beispielzellen berechnet. Fehlerbalken stellen S.E.M. aus einzelnen Zellen dar, im Fall von n>1 wurden die Werte hier nicht für statistische Analysen verwendet, sondern lediglich als Beispiel für Messungen, die mit den verschiedenen Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Differentialdynamik von Cxcr1 und Cxcr2 als Reaktion auf Verwundung. (A) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT)- oder Tg(lyz:Cxcr2-FT)-Larven an der Wunde bei 80 min nach der Wunde (sfGFP-Kanal gezeigt). Maßstabsleiste = 10 μm.  (B) Vergrößertes Cxcr1-FT-Neutrophil (links) und Cxcr2-FT (rechts) an der Wunde. Grüner Rezeptor ist in Grau dargestellt. Skalenbalken = 5 μm. (C) Normalisierter Kontrast (Kontrast pro individuellem Neutrophilen, normalisiert auf den mittleren Kontrast von nicht mobilisierten Zellen in der CHT). CXCl8A bezieht sich auf die Injektion eines Spleißblockers zusammen mit einem translationsblockierenden Morpholino für CXCL8A. CXCl8B bezieht sich auf die Injektion mit einem Spleiß-blockierenden Morpholino für CXCl8B. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 Zellen (CHT), n=47 Zellen (Wunde) von 8 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT) mit Morpholinos: n=28 Zellen (Cxcl8a-MO) aus 5 Larven, n=16 Zellen (Cxcl8b-MO) aus 5 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 Zellen (CHT) und n=20 Zellen (Wunde) aus 3 Larven. Die Daten wurden von unabhängigen Larven gepoolt, die in 1-5 Bildgebungssitzungen aufgenommen wurden. Kruskal-Wallis-Test mit Dunns multiplem Vergleichstest für Tg(lyz:Cxcr1-FT), zweiseitiger ungepaarter Mann-Whitney-Test für Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgenen Larven, die mit cxcl8a morpholino (MO) (links) und cxcl8b MO (rechts) behandelt wurden, die auf Flossenwunden ansprechen (sfGFP-Kanal grün dargestellt). Schnappschuss aufgenommen zu Zeitpunkten äquivalenter Neutrophilenakkumulation (85 min nach der Verwundung im linken Bild und 45 min nach der Verwundung im rechten Bild). Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Abbildung 5: Chemokin-Response-Assay in frühen Embryonen. Laserscanning konfokaler Scheiben von gastrulatierenden Embryonen, die Expression und Verteilung von Cxcr1-FT zeigen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA wurden in ein Zellstadium Eizellen mit oder ohne 150 pg Cxcl8a mRNA injiziert. Grüne und rote Rezeptoren werden in separaten Kanälen gezeigt. Der Kontrollmembran-CFP-Marker (mCFP) ist im Cyan-Kanal dargestellt. Maßstabsleiste = 20 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatzfilm 1: Transgene Neutrophile im Kopf einer Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) Larve bei 3 dpf. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 5 fps. Maßstabsleiste = 20 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 2: Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgenen Larven, die auf Flossenwunden reagieren. Der Film beginnt innerhalb von 10 Minuten nach der Wunde und dauert 60 Minuten. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 10 fps. CHT = kaudales hämatopoetisches Gewebe. VF = Bauchflosse. Maßstabsleiste = 25 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 3. Zusätzliche Beispiele von Neutrophilen aus einer verwundeten transgenen Tg(lyz:Cxcr1- FT)-Larve (andere Larve als in Video 2), die mit höherer Auflösung aufgenommen wurden und eine Rezeptorinternalisierung (sfGFP-Kanal grün dargestellt) bei Mobilisierung in der CHT oder beim Eintritt und Chemotaxis in der Bauchflosse zeigen. Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 2 fps. Maßstabsleiste = 10 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Aufrufe.  University of Cambridge. Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Serie: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Immunologie und Infektion

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biologie

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photokonversionsbasiertes Leukozyten-Tracking in bakteriell infizierten transgenen Zebrafischen

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...