Diese Forschung wurde vom Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) von AMED unter der Fördernummer JP20am0101077 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709 unterstützt.

1. Herstellung von pEU-Expressionsplasmid
HINWEIS: Das pEU-Expressionsplasmid sollte Startcodon, offenen Leserahmen des Zielmembranproteins und Stopcodon im Fragment enthalten (siehe Abbildung 1). Fügen Sie bei Bedarf Erkennungs-/Reinigungs-Tag-Sequenz(en) an der entsprechenden Position hinzu. Für das Subklonen ist entweder die Restriktionsenzymverdauung oder das nahtlose Klonen anwendbar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine nahtlose Klonmethode verwendet.
<ol><li>Bereiten Sie das DNA-Fragment vor.<ol><li>Amplifizieren Sie das interessierende Gen durch PCR unter Verwendung der cDNA-Vorlage, Primer 1 und Primer 2. Primer 1 und Primer 2 enthalten 15 bp Überlappungen für nahtloses Klonen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Fügen Sie keine Sequenzen hinzu, die verarbeitet und aus reifem Protein in den Zellen entfernt werden sollen (z. B. Signalsequenz). Die Verarbeitung von synthetisiertem Protein wird nicht im weizenzellenfreien System durchgeführt. Fügen Sie keine Kozak-Sequenz hinzu. Der pEU-E01-MCS-Vektor hat einen E01-Translationsverstärker.</li>
		<li>Fügen Sie dem PCR-Produkt 1/25 Volumen des DpnI-Restriktionsenzyms hinzu, um die Template-Plasmid-DNA zu entfernen. 30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit, um das PCR-Produkt zu reinigen und die Konzentration bei 20-50 ng / μl einzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Linearisieren Sie den pEU-E01-MCS-Vektor.<ol><li>Führen Sie eine inverse PCR mit pEU-E01-MCS, Primer 3 und Primer 4 durch.</li>
		<li>Fügen Sie dem inversen PCR-Produkt 1/25 Volumen des DpnI-Restriktionsenzyms hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit, um das PCR-Produkt gemäß der Empfehlung des Herstellers zu reinigen. Stellen Sie die Konzentration auf 20–50 ng/μL ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Mischen Sie 2 μL DNA-Fragment, 2 μL linearisierten Vektor und 4 μL 2x nahtlose Klonenzymmischung.</li>
	<li>Transformieren Sie den Escherichia coli-Stamm JM109 mit dem nahtlosen Klonprodukt. Verteilen Sie die Bakteriensuspension mit einem Streuer auf einer LB-Ampicillin-Agarplatte. HINWEIS: pEU-Vektor hat einen Ampicillin-Widerstandsmarker.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Sequenz des Expressionsplasmids, das unter Verwendung von Primer 5 und Primer 6 von der 5'- bzw. 3'-Seite von MCS im pEU-Plasmid konstruiert wurde.</li>
	<li>Amplifizieren und reinigen Sie die Expressionsplasmide.<ol><li>Kultur des plasmidtransformierten E . coli-Stammes JM109 in 150 ml LB-Ampicillin-Medium bei 37 °C und 125 Hüben pro Minute unter Schütteln über Nacht.</li>
		<li>Extrahieren und reinigen Sie die Plasmide mit handelsüblichen Plasmid-Prep-Midi-Kits. Plasmide werden in 500 μL TE-Puffer gelöst. VORSICHT: Verwenden Sie kein Mini-Vorbereitungskit für die Plasmidextraktion. Es bietet keine ausreichende Qualität und Quantität des Plasmids.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μL Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol hinzu (25:24:1). 5 min kräftig mischen und 5 min bei 17.800 x g Raumtemperatur zentrifugieren. Die obere Plasmidlösung in ein neues Röhrchen überführen. ACHTUNG: Tragen Sie Einweghandschuhe, um die Haut vor Phenol und Chloroform zu schützen. HINWEIS: Um die Kontamination von RNase aus dem Plasmidextraktionskit zu entfernen, reinigen Sie die Plasmide mit Phenol-Chloroform-Reinigung.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μL Chloroform hinzu, um Phenol vollständig zu entfernen. 5 min kräftig mischen und 5 min bei 17.800 x g Raumtemperatur zentrifugieren. Die obere Plasmidlösung in ein neues Röhrchen überführen.</li>
		<li>2,5 Volumen Ethanol und 1/8 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat zugeben und bei -30 °C 1 h lagern.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 17.800 x g bei 4 °C für 10 min. Waschen Sie das Pellet mit 500 μL 70% Ethanol. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Pellet 5 min trocknen.</li>
		<li>Lösen Sie die Expressionsplasmide vollständig in 100 μL Reinstwasser auf. Messen Sie die Konzentration von Plasmiden mit Absorption bei 260 nm. Stellen Sie die Konzentration auf 1 mg/ml ein.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In-vitro-Transkription
VORSICHT: Verwenden Sie DNase- und nukleasefreie Kunststoffröhrchen und -spitzen in Schritten der Transkription und Translation. Vermeiden Sie das Autoklavieren von Kunststoffwaren, um eine Kontamination zu vermeiden.
<ol><li>Ernten Sie Reinstwasser in einem neuen Kunststoffrohr. VORSICHT: Verwenden Sie kein DEPC-behandeltes Wasser, da Rest-DEPC die Reaktion stark hemmt. Verwenden Sie frisch gereinigtes Reinstwasser für die Transkription und Übersetzung.</li>
	<li>Herstellen einer Transkriptionsreaktionsmischung durch Mischen von 115,2 μL Reinstwasser, 40 μL Transkriptionspuffer LM, 20 μL NTP-Mischung, 2,4 μL 80 U/μL RNase-Inhibitor, 2,4 μL 80 U/μL SP6-Polymerase und 20 μL 1 mg/ml pEU-Expressionsplasmiden. Mischen Sie die Reagenzien vorsichtig durch Umdrehen. Führen Sie eine schnelle Drehung durch.</li>
	<li>Die Transkriptionsreaktion wird bei 37 °C für 6 h inkubiert.</li>
	<li>Mischen Sie die Reaktion vorsichtig, indem Sie sie umkehren und schnell herunterdrehen. Verwenden Sie es sofort für die Übersetzung, ansonsten einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Bestätigen Sie das Transkriptionsprodukt durch Elektrophorese.<ol><li>Mischen Sie 100 ml 1x TAE-Puffer und 1 g Agarose. Erhitzen Sie die Suspension in einer Mikrowelle, um 1% Agarose TAE-Gel herzustellen.</li>
		<li>Man nimmt 1 μL Transkriptionsreaktion und mischt mit 3 μL Wasser und 4 μL 2x Ladenfarbstoff. HINWEIS: Eine Denaturierung der RNA ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Laden Sie 4 μL der Mischung und 2 μL DNA-Leitermarker in das Agarose-TAE-Gel.</li>
		<li>Elektrophorese bei 100 V für 20 min.</li>
		<li>Färben Sie das Gel in Ethidiumbromid für 30 min. Überprüfen Sie das Leiterbandmuster der mRNA mit UV-Transilluminator und Gel-Imager. HINWEIS: Wenn eine verschmierte Bande von weniger als 500 bp beobachtet wird, wird ein mRNA-Abbau vermutet.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung der Materialien für die Übersetzung
<ol><li>Bereiten Sie den Übersetzungspuffer vor.<ol><li>Mischen Sie 27 ml frisch zubereitetes Reinstwasser und 0,75 ml jeder 40-fachen Stammlösung für S1, S2, S3 und S4 in einem 50-ml-Röhrchen. HINWEIS: Modulieren Sie die Materialmengen entsprechend der endgültigen erforderlichen Menge an 1x Übersetzungspuffer. ACHTUNG: Lagern oder frieren Sie den überschüssigen 1x-Übersetzungspuffer nach Gebrauch nicht wieder ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Kreatinkinase-Stammlösung vorbereiten. Lyophilisierte Kreatinkinase in Reinstwasser auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml auflösen. Die Lösung wird in kleinen Mengen (jeweils 10 bis 50 μL) in 0,2 ml 8-Streifen-PCR-Röhrchen verabreicht. Die Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. ACHTUNG: Kreatinkinaselösung nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.</li>
	<li>Waschen Sie Dialysebecher (Größe 0,1 ml), um Glycerin aus der Dialysemembran zu entfernen. HINWEIS: Es gibt mehrere Dialysebecher unterschiedlicher Größe. Kleine Becher (0,1 ml) werden für Tests in kleinem Maßstab (Abschnitt 5.4) bzw. großformatige Becher (2 ml) für die Großproduktion (Abschnitt 5.5) verwendet. Der Waschschritt der Dialysemembran von großformatigen Bechern ist vermeidbar.<ol><li>Geben Sie 1 ml Reinstwasser in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Führen Sie einen kleinen Dialysebecher (0,1 ml) in das Röhrchen ein. Fügen Sie 0,5 ml Reinstwasser in die Tasse hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie länger als 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Herstellung von Liposomen
HINWEIS: Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Herstellung von Liposomen. Einer verwendet gebrauchsfertige lyophilisierte Liposomen (Abschnitt 4.1), während der andere Liposomen durch Hydratisieren eines dünnen Lipidfilms produziert (Abschnitt 4.2).
<ol><li>Bereiten Sie Liposomen mit lyophilisierten Liposomen vor. HINWEIS: Ein einfacherer Weg, Proteoliposom zu produzieren, ist die Verwendung von kommerziell erhältlichem Asolectin-Liposom. Asolectin ist eine Art natürliches Lipid, das aus Sojabohnen gewonnen wird.<ol><li>Öffnen Sie die Durchstechflasche mit 10 mg lyophilisierten Asolectin-Liposomen (siehe Materialtabelle) und geben Sie 200 μl Translationspuffer (Abschnitt 3.1) auf den Boden der Durchstechflasche. Die Durchstechflasche verschließen und 10 min inkubieren.</li>
		<li>Mischen Sie kräftig, indem Sie die Durchstechflasche für 1 min auf den Vortex-Mixer legen.</li>
		<li>Führen Sie die Durchstechflasche in ein 50-ml-Röhrchen ein. Schleudern Sie das Röhrchen durch Zentrifugieren mit 500 x g für 1 min.</li>
		<li>Die Asolectin-Liposomensuspension (50 mg Lipid/ml) wird mit einer Pipette in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt. Liposom sofort zur Translation verwenden, ansonsten in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie Liposomen vor, indem Sie einen dünnen Lipidfilm hydratisieren.<ol><li>Wenn ein Lipid in Pulverform verkauft wird, lösen Sie es in Chloroform oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel auf eine Konzentration von 10-100 mg / ml. HINWEIS: Ein dünner Lipidfilm kann unter Verwendung gereinigter und/oder synthetisierter amphiphiler Lipide hergestellt werden. Das Reinigungsverfahren von Asolectin ist bereits beschrieben38. Funktionell modifizierte Lipide, wie biotinylierte Lipide, fluoreszierende Lipide und adjuvante Lipide, können den Basallipiden zugesetzt werden, um funktionelle Liposomen zu erzeugen.</li>
		<li>Die Lipidlösung, die 50 mg Lipid(e) enthält, wird in einen Verdampfungskolben überführt.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer und verteilen Sie das Lipid gleichmäßig auf der Wand des Kolbenbodens, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden.</li>
		<li>Der Kolben wird in einen Vakuum-Exsikkator gegeben und über Nacht unter Unterdruck stehen gelassen, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen.</li>
		<li>1 ml Translationspuffer in den Verdampfungskolben geben. Drehen Sie den Kolben, um den Puffer über den dünnen Lipidfilm zu verteilen. 5 min inkubieren, um den Film mit Feuchtigkeit zu versorgen.</li>
		<li>Beschallen Sie den Kolben mit einem Ultraschallhomogenisator oder Ultraschallreiniger. Ändern Sie gelegentlich den Winkel des Kolbens, damit die Lösung den Film gründlich berühren kann. Stellen Sie sicher, dass der dünne Lipidfilm von unten abgezogen und vollständig und homogen emulgiert wird. HINWEIS: Die elektronenmikroskopische Aufnahme von biotinylierten Lipiden, die Liposomen enthalten, ist in Abbildung 1 dargestellt.</li>
		<li>Die Liposomensuspension (50 mg Lipide/ml) wird in ein neues 1,5 ml Röhrchen überführt. Wenn es nicht sofort verwendet werden soll, frieren Sie die Liposomen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. In-vitro-Übersetzung
<ol><li>Tauen Sie den Weizenkeimextrakt schnell auf, indem Sie die Röhrchen einige Minuten auf Wasser bei Raumtemperatur schwimmen lassen. Nach dem Auftauen sofort vorsichtig mischen, indem Sie die Röhrchen umdrehen, herunterdrehen und bis zum Gebrauch auf Eis kühlen. HINWEIS: Weizenkeimextrakt nach Gebrauch in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Es übersteht mehrere Gefrier-/Tauzyklen.</li>
	<li>20 mg/ml Kreatinkinase-Stammlösung auftauen. Mischen Sie 5 μL Stammlösung und 45 μL Translationspuffer, um 2 mg/ml Kreatinkinase-Arbeitslösung herzustellen. ACHTUNG: Das erneute Einfrieren der Kreatinkinase wird nicht empfohlen.</li>
	<li>Liposomen oder mRNAs bei Bedarf auftauen.</li>
	<li>Führen Sie eine Proteinübersetzung in kleinem Maßstab durch.<ol><li>Wasser aus dem Röhrchen und dem Dialysebecher (0,1 ml) entfernen, wie in Schritt 3.3.2 vorbereitet.</li>
		<li>Injizieren Sie 1 ml bzw. 300 μL Translationspuffer in das Röhrchen bzw. den Dialysebecher. VORSICHT: Falls der Boden des Dialysebechers die Oberfläche des Translationspuffers im 1,5-ml-Röhrchen nicht erreicht, injizieren Sie zusätzliche 50-100 μL Puffer in den Schlauch.</li>
		<li>Präparation der Translationsreaktionsmischung durch Mischen von 15,6 μL Translationspuffer, 2,4 μL 2 mg/ml Kreatinkinase, 12 μL 50 mg/ml Liposomen, 15 μL Weizenkeimextrakt und 15 μL mRNA. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Röhrchen umdrehen, und drehen Sie sie nach unten.</li>
		<li>60 μL des Translationsreaktionsgemisches werden mit einer 200 μL Pipette abgesaugt.</li>
		<li>Führen Sie die Pipettenspitze in die Unterseite des Translationspuffers im Dialysebecher ein. Pipetten Sie das Reaktionsgemisch langsam und vorsichtig heraus. Decken Sie den Dialysebecher mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern. HINWEIS: Das Reaktionsgemisch sinkt auf natürliche Weise auf den Boden des Bechers und bildet eine Doppelschicht. Stören Sie die Doppelschicht nicht, indem Sie die Tasse mischen oder schütteln.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine umfangreiche Übersetzung durch (Abbildung 1).<ol><li>Gießen Sie 22 mL Translationspuffer in ein 25 ml Röhrchen. Führen Sie einen großen Dialysebecher (2 ml) in das Röhrchen ein und geben Sie 2 ml Translationspuffer in den Becher.</li>
		<li>Präparation einer Translationsreaktionsmischung durch Mischen von 130 μL Translationspuffer, 20 μL 2 mg/ml Kreatinkinase, 100 μL 50 mg/ml Liposom, 125 μL Weizenkeimextrakt und 125 μL mRNA. Durch Pipettieren vorsichtig mischen.</li>
		<li>Das gesamte Translationsreaktionsgemisch (500 μL) wird mit einer 1.000 μL Pipette abgesaugt. Das Translationsreaktionsgemisch wird wie in Schritt 5.4.5 beschrieben in den Dialysebecher injiziert. Decken Sie den Dialysebecher mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Reaktionen werden bei 15 °C für 24 h inkubiert.</li>
	<li>Mischen Sie die Reaktion gut im Dialysebecher durch Pipettieren. Übertragen Sie die rohe Proteoliposomensuspension in ein neues Röhrchen. HINWEIS: Ein 1,5-ml-Röhrchen mit flachem Boden wird empfohlen, um das Proteoliposom aus der kleinskaligen Translation zu sammeln. Nach der Zentrifugation bilden Liposomen ein kompaktes und gut sichtbares Pellet an der unteren Ecke des Röhrchens.</li>
</ol>6. Reinigung von Proteoliposomen
<ol><li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der rohen Proteoliposomensuspension bei 17.800 x g bei 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Proteoliposomenpellet in PBS (kleiner Maßstab: 1 ml, großer Maßstab: 10 ml) durch Pipettieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation und das Waschen von Proteoliposomen für weitere zwei Kreise.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem Waschen eine kleine Menge PBS hinzu und suspendieren Sie das Proteoliposomenpellet gut durch Pipettieren. Messen Sie das Volumen der Suspension mit einer Mikropipette. Fügen Sie PBS hinzu, um das Volumen auf 60 μL (kleiner Maßstab) oder 500 μL (großer Bereich) einzustellen. Die Suspension wird in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 μL Proteoliposom-Suspension in ein neues PCR-Röhrchen für SDS-PAGE. Teilen Sie den Rest der Proben in kleinere Portionen, um sie bei Bedarf zu verwenden. In flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
</ol>7. SDS-PAGE und CBB-Färbung
<ol><li>Fügen Sie 70 μL Wasser und 40 μL 3x SDS-PAGE Probenpuffer zu 10 μL Proteoliposomensuspension hinzu. ACHTUNG: Kochen Sie die SDS-PAGE-Probe nicht, da Membranproteine aggregieren und bei der Elektrophorese kaum in das Acrylamidgel eindringen. Fügen Sie außerdem genügend Reduktionsmittel zum SDS-PAGE-Probenpuffer hinzu (z. B. 2-Mercaptoethanol bei 3% Endkonzentration), um eine Oxidation zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie ein SDS-PAGE-Gel mit einem Farbverlauf von 5 % bis 20 % in eine Elektrophoresekammer. Laden Sie 3 μL, 6 μL, 12 μL Proteoliposomenproben, 2 μL Proteingrößenmarker und BSA-Standardserien.</li>
	<li>Elektrophorese bei 52 mA, 400 V für 30 min.</li>
	<li>Färben Sie das Gel mit CBB-Farbstoff für 1 h. In heißem Wasser entfärben und das Gelbild scannen.</li>
	<li>Quantifizieren Sie mithilfe der NIH Image J-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) die Bandenintensität des Membranproteins in jeder Bahn. Schätzen Sie die Menge der synthetisierten Membranproteine mit BSA-Standardreihen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorgestellte Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Membranproteinen mit einer hohen Erfolgsrate. Dieses Protokoll ist einfach, hochgradig reproduzierbar und leicht zu skalieren. Es hat auch das Potenzial, den Zeit- und Kostenaufwand für Experimente zu reduzieren, die eine große Menge an Membranproteinen verbrauchen. Die Zweischichtdialysemethode verbessert die Produktivität um das 4- bis 10-fache im Vergleich zur Doppelschichtmethode oder Dialysemethode (Abbildung 2B)<sup ...

Membranproteine sind eines der wichtigsten Wirkstoffziele in Diagnose und Therapie. Tatsächlich sind die Hälfte der kleinen Wirkstoffe Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanäle1. Im Laufe der Jahre haben Forscher an biochemischen, biophysikalischen und strukturellen Studien von Membranproteinen gearbeitet, um ihre Struktur und Funktion aufzuklären 2,3. Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Membranproteine wird ebenfalls aktiv durchgeführt, um funktionelle und strukturelle Studien zu beschleunigen und therapeutische und diagnostische Anwendungen zu entwickeln 4,5,6,7,8,9. Alle diese Studien erfordern eine große Menge an hochwertigen Membranproteinen10. So werden beispielsweise mehrere Milligramm gereinigte Membranproteine mit natürlicher Konformation für die Antikörperentwicklung benötigt. Für die Röntgenkristallographie wird eine viel größere Menge an hochgereinigten Membranproteinen benötigt. Die Massenproduktion von Membranproteinen bleibt jedoch ein Engpass in der Membranproteinforschung11. Membranproteine haben komplizierte Strukturen mit einer oder mehreren Transmembranhelices und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellhomöostase. Die heterologe Überexpression von Membranproteinen führt zu mehreren Hindernissen wie der Aggregation von Membranproteinen, die sich in hohen lokalen Konzentrationen ansammeln, oder der Störung zellulärer Signalwege. Selbst wenn die Expression erfolgreich ist, stoßen auch nachfolgende Schritte der Probenvorbereitung auf Schwierigkeiten. Zum Beispiel erfordert die Herstellung von Proteoliposom hohe Fähigkeiten und Berufserfahrung in der Solubilisierung, Reinigung und Stabilisierung von Membranproteinen und kostet viel Aufwand und Zeit12,13.
Auf der anderen Seite sind in den letzten Jahrzehnten einige fortschrittliche Technologien entstanden, um Proteine ohne die Verwendung lebender Zellen herzustellen 14,15,16,17,18. Die zellfreie Proteinsynthesetechnologie rekonstruiert die Translationsreaktion in einem Reagenzglas. Da es keine Einschränkungen gibt, die das zelluläre Expressionssystem hat, haben zellfreie Systeme das Potenzial, eine Vielzahl von Proteinen zu synthetisieren, die schwer zu exprimieren sind oder Toxizität in Zellen zeigen. Gereinigter Zellextrakt oder rekonstituierte translationale Maschinerie wird mit Template-mRNAs, Aminosäuren und Energiequellen gemischt, und rekombinante Proteine werden in kurzer Zeit synthetisiert. In Bezug auf die Membranproteinsynthese werden einige Arten von Gerüsten, die aus Lipiden oder Amphiphilen bestehen, wie Liposomen, Bizellen, Nanoscheiben oder Copolymere, zur zellfreien Reaktion 19,20,21,22,23,24 hinzugefügt. Synthetisierte Membranproteine interagieren mit den Gerüsten und können in Wasser stabilisiert werden. Zellfreie synthetisierte Membranproteine werden häufig in funktionellen Studien und der Antikörperproduktion verwendet 25,26,27,28,29,30,31.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine effiziente zellfreie Methode der Proteoliposomenproduktion unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Weizenzellfreies Proteinsynthesesystem ist ein leistungsfähiges In-vitro-Translationssystem mit Extrakt aus Weizenkeimen 15,32,33. Weizenkeime enthalten eine große Menge an translationalen Maschinen und wenige Translationshemmer. Die translationale Maschinerie in Weizen, einem Mitglied der Eukaryoten, eignet sich für die Translation eukaryotischer Proteine, und seine Translationseffizienz wird durch die Codonverwendung der Template-mRNA kaum beeinflusst. Unter Verwendung des weizenzellfreien Systems haben wir eine Vielzahl von Proteinen synthetisiert, darunter Proteinkinasen34,35, Ubiquitin-Ligasen36, Transkriptionsfaktoren37 und Membranproteine mit hohen Erfolgsraten. Für die Membranproteinproduktion fügen wir Lipidvesikelliposom als Gerüst19,38 in die Translationsmischung ein. Hydrophobe Domänen des Membranproteins interagieren mit der Lipiddoppelschicht und sind spontan in das Liposom integriert. Die Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um Proteoliposom von endogenen Weizenproteinen strikt zu trennen, obwohl eine gemeinsame Zentrifugation des Translationsreaktionsgemisches für eine einfache Reinigung von Proteoliposom20 ausreicht. Viele Arten von integralen Membranproteinen wurden mit einem weizenzellenfreien System synthetisiert und für verschiedene Forschungen und Entwicklungen 25,38,39,40,41,42,43,44 angewendet. Darüber hinaus haben wir das "Bilayer-Dialyse-Verfahren" für die Großserienproduktion45,46 entwickelt. Bei diesem Verfahren wird ein Becherdialysegerät in den Substratzufuhrpuffer eingetaucht, und es werden zwei Schichten Translationsreaktionsgemisch und Substratzuführpuffer im Becher gebildet, wie in Abbildung 1 gezeigt. Die kontinuierliche Zuführung von Substraten und die Entfernung des Nebenprodukts kann sowohl oben als auch unten des Reaktionsgemisches über einen langen Zeitraum effizient durchgeführt werden, was zu einer hervorragenden Translationseffizienz führt (Abbildung 2A und Abbildung 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membranproteine spielen eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und erfüllen lebenswichtige Funktionen. Membranproteine sind in der Wirkstoffforschung von medizinischer Bedeutung, da sie das Ziel von mehr als der Hälfte aller Medikamente sind. Ein Hindernis für die Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Studien von Membranproteinen sowie für die Antikörperentwicklung war die Schwierigkeit, große Mengen an hochwertigem Membranprotein mit korrekter Konformation und Aktivität herzustellen. Hier beschreiben wir eine "Bilayer-Dialysemethode" mit einem weizenkeimzellfreien System, Liposomen und Dialysebechern, um Membranproteine effizient zu synthetisieren und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsrate herzustellen. Membranproteine können ebenso hergestellt werden wie in mehreren Milligramm, wie GPCRs, Ionenkanälen, Transportern und Tetraspaninen. Diese zellfreie Methode trägt dazu bei, Zeit, Kosten und Aufwand für die Herstellung hochwertiger Proteoliposomen zu reduzieren und bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Antikörperentwicklung.

Mit diesem Protokoll können teilweise gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit erhalten werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Fünfundzwanzig GPCRs der Klassen A, B und C wurden erfolgreich mit der Doppelschichtdialysemethode (kleiner Maßstab) synthetisiert und teilweise durch Zentrifugation und Pufferwäsche gereinigt. Obwohl die Menge der synthetisierten Proteine je nach Proteintyp variiert, können bei Verwendung großer Dialysebecher in der Regel 50 bis ...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.6K Aufrufe.  Ehime University. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Serie: Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Forschung

Biochemie

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...