Questa ricerca è stata supportata dal Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) di AMED con il numero di sovvenzione JP20am0101077. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dal JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Preparazione del plasmide di espressione pEU
NOTA: il plasmide di espressione pEU deve includere il codone iniziale, il frame di lettura aperto della proteina di membrana bersaglio e il codone di arresto nel frammento (vedere Figura 1). Aggiungere sequenze di tag di rilevamento/purificazione nella posizione appropriata quando necessario. Per la subclonazione è applicabile la digestione enzimatica di restrizione o la clonazione senza soluzione di continuità. Qui descriviamo un protocollo che utilizza un metodo di clonazione senza soluzione di continuità.
<ol><li>Preparare inserire un frammento di DNA.<ol><li>Amplificare il gene di interesse mediante PCR utilizzando il modello di cDNA, primer 1 e primer 2. Il primer 1 e il primer 2 contengono rispettivamente sovrapposizioni di 15 bp per una clonazione senza soluzione di continuità (vedere la tabella dei materiali). NOTA: Non includere sequenze da elaborare e rimuovere da proteine mature nelle cellule (ad esempio, sequenza di segnali). L'elaborazione delle proteine sintetizzate non viene eseguita nel sistema privo di cellule di grano. Non aggiungere la sequenza Kozak. Il vettore pEU-E01-MCS ha un potenziatore di traduzione E01.</li>
		<li>Aggiungere 1/25 di volume dell'enzima di restrizione DpnI al prodotto PCR per rimuovere il DNA plasmidico modello. Incubare per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Utilizzare un kit di purificazione PCR per purificare il prodotto PCR e regolare la concentrazione a 20-50 ng / μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Linearizzare il vettore pEU-E01-MCS.<ol><li>Condurre la PCR inversa utilizzando pEU-E01-MCS, primer 3 e primer 4.</li>
		<li>Aggiungere 1/25 di volume dell'enzima di restrizione DpnI al prodotto PCR inverso. Incubare per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Utilizzare un kit di purificazione PCR per purificare il prodotto PCR secondo la raccomandazione del produttore. Regolare la concentrazione a 20–50 ng/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Mescolare 2 μL di frammento di DNA inserito, 2 μL di vettore linearizzato e 4 μL di miscela enzimatica di clonazione 2x senza soluzione di continuità.</li>
	<li>Trasforma Escherichia coli ceppo JM109 con il prodotto di clonazione senza soluzione di continuità. Utilizzando uno spargitore, distribuire la sospensione batterica su una piastra di agar di ampicillina LB. NOTA: il vettore pEU ha un marcatore di resistenza all'ampicillina.</li>
	<li>Confermare la sequenza del plasmide di espressione costruita utilizzando primer 5 e primer 6 dal lato 5' e 3' di MCS nel plasmide pEU, rispettivamente.</li>
	<li>Amplificare e purificare i plasmidi di espressione.<ol><li>Coltura del ceppo di E. coli trasformato plasmidico JM109 in 150 mL di mezzo di ampicillina LB a 37 °C e agitazione di 125 colpi al minuto durante la notte.</li>
		<li>Estrarre e purificare i plasmidi utilizzando il kit midi di preparazione del plasmide disponibile in commercio. Sciogliere i plasmidi in 500 μL di tampone TE. ATTENZIONE: Non utilizzare un mini kit di preparazione per l'estrazione del plasmide. Non fornisce sufficiente qualità e quantità di plasmide.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1). Mescolare energicamente per 5 minuti e centrifugare per 5 minuti a 17.800 x g e temperatura ambiente. Trasferire la soluzione plasmidica superiore in un nuovo tubo. ATTENZIONE: Indossare guanti monouso per proteggere la pelle da fenolo e cloroformio. NOTA: Al fine di rimuovere la contaminazione della RNasi dal kit di estrazione del plasmide, purificare i plasmidi utilizzando la purificazione fenolo-cloroformio.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di cloroformio per rimuovere completamente il fenolo. Mescolare energicamente per 5 minuti e centrifugare per 5 minuti a 17.800 x g e temperatura ambiente. Trasferire la soluzione plasmidica superiore in un nuovo tubo.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 volume di etanolo e 1/8 di volume di acetato di ammonio 7,5 M e conservare a -30 °C per 1 ora.</li>
		<li>Centrifugare a 17.800 x g a 4 °C per 10 min. Lavare il pellet con 500 μL di etanolo al 70%. Rimuovere accuratamente il surnatante e lasciare asciugare il pellet per 5 minuti.</li>
		<li>Sciogliere completamente i plasmidi di espressione in 100 μL di acqua ultrapura. Misurare la concentrazione di plasmidi con assorbanza a 260 nm. Regolare la concentrazione a 1 mg/ml.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Trascrizione in vitro
ATTENZIONE: Utilizzare tubi e punte di plastica privi di DNasi e nucleasi nelle fasi di trascrizione e traduzione. Evitare l'autoclave di articoli di plastica per prevenire la contaminazione.
<ol><li>Raccogliere acqua ultrapura in un nuovo tubo di plastica. ATTENZIONE: Non utilizzare acqua trattata con DEPC perché il DEPC residuo inibisce fortemente la reazione. Utilizzare acqua ultrapura appena purificata per la trascrizione e la traduzione.</li>
	<li>Preparare la miscela di reazione di trascrizione miscelando 115,2 μL di acqua ultrapura, 40 μL di Tampone Trascrizionale LM, 20 μL di miscela NTP, 2,4 μL di 80 U/μL di inibitore della RNasi, 2,4 μL di 80 U/μL SP6 polimerasi e 20 μL di plasmidi di espressione pEU da 1 mg/ml. Mescolare delicatamente i reagenti capovolgendo. Esegui un giro veloce.</li>
	<li>Incubare la reazione di trascrizione a 37 °C per 6 ore.</li>
	<li>Mescolare delicatamente la reazione capovolgendo e ruotare rapidamente verso il basso. Utilizzarlo immediatamente per la traduzione, altrimenti congelare e conservare a -80 °C.</li>
	<li>Confermare il prodotto di trascrizione mediante elettroforesi.<ol><li>Mescolare 100 ml di 1x tampone TAE e 1 g di agarosio. Riscaldare la sospensione in un forno a microonde per preparare il gel TAE di agarosio all'1%.</li>
		<li>Prelevare 1 μL di reazione di trascrizione e mescolare con 3 μL di acqua e 4 μL di colorante di carico 2x. NOTA: La denaturazione dell'RNA non è richiesta.</li>
		<li>Caricare 4 μL della miscela e 2 μL del marcatore della scala del DNA sul gel TAE dell'agarosio.</li>
		<li>Elettroforesi a 100 V per 20 min.</li>
		<li>Colorare il gel in bromuro di etidio per 30 min. Controllare il modello di banda della scala di mRNA utilizzando il transilluminatore UV e l'imager del gel. NOTA: Quando si osserva una banda spalmata inferiore a 500 bp, si sospetta una degradazione dell'mRNA.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione dei materiali per la traduzione
<ol><li>Preparare il buffer di traduzione.<ol><li>Mescolare 27 ml di acqua ultrapura appena preparata e 0,75 ml di ciascuna soluzione madre 40x per S1, S2, S3 e S4, rispettivamente in un tubo da 50 ml. NOTA: modulare la quantità di materiali in base alla quantità finale richiesta di 1x buffer di traduzione. ATTENZIONE: non conservare o ricongelare il buffer di conversione 1x in eccesso dopo l'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare la soluzione madre di creatinchinasi. Sciogliere la creatinchinasi liofilizzata in acqua ultrapura fino a una concentrazione finale di 20 mg/ml. Erogare la soluzione in piccole quantità (da 10 a 50 μL ciascuna) in provette PCR a 8 strisce da 0,2 ml. Congelare i tubi in azoto liquido e conservare a -80 °C. ATTENZIONE: Non ricongelare la soluzione di creatinchinasi dopo lo scongelamento.</li>
	<li>Lavare le coppette di dialisi (dimensioni 0,1 ml) per rimuovere il glicerolo dalla membrana di dialisi. NOTA: Ci sono diverse coppe di dialisi di dimensioni diverse. Tazze di piccole dimensioni (0,1 ml) sono utilizzate rispettivamente per test su piccola scala (sezione 5.4) e tazze di grandi dimensioni (2 ml) per la produzione su larga scala (sezione 5.5). La fase di lavaggio della membrana di dialisi di coppette di grandi dimensioni è evitabile.<ol><li>Mettere 1 mL di acqua ultrapura in un nuovo tubo da 1,5 mL. Inserire una coppa di dialisi di piccole dimensioni (0,1 ml) nel tubo. Aggiungere 0,5 ml di acqua ultrapura nella tazza.</li>
		<li>Incubare per più di 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparazione dei liposomi
NOTA: Qui descriviamo due protocolli per la preparazione dei liposomi. Uno utilizza liposomi liofilizzati pronti all'uso (sezione 4.1), mentre l'altro produce liposomi idratando un sottile film lipidico (paragrafo 4.2).
<ol><li>Preparare liposomi usando liposomi liofilizzati. NOTA: Un modo più semplice per produrre proteoliposomi è quello di utilizzare liposoma Asolectin disponibile in commercio. L'asolectina è un tipo di lipide naturale estratto dalla soia.<ol><li>Aprire il flaconcino contenente 10 mg di liposomi di asolectina liofilizzati (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere 200 μL di tampone di traduzione (paragrafo 3.1) sul fondo del flaconcino. Sigillare il flaconcino e incubare per 10 min.</li>
		<li>Mescolare energicamente mettendo il flaconcino sul miscelatore a vortice per 1 minuto.</li>
		<li>Inserire il flaconcino in un tubo da 50 ml. Centrifugare il tubo centrifugando a 500 x g per 1 minuto.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione liposomica di asolectina (50 mg lipidi/ml) in una nuova provetta da 1,5 ml. Utilizzare immediatamente il liposoma per la traduzione, altrimenti congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare i liposomi idratando un sottile film lipidico.<ol><li>Se un lipide viene venduto in polvere, sciogliere in cloroformio o solvente organico appropriato a 10-100 mg / mL concentrazione. NOTA: Un sottile film lipidico può essere preparato utilizzando lipidi anfifilici purificati e/o sintetizzati. Il metodo di purificazione dell'asolectina è precedentemente descritto38. I lipidi funzionalmente modificati, come i lipidi biotinilati, i lipidi fluorescenti e i lipidi adiuvanti, possono essere aggiunti ai lipidi basali per produrre liposomi funzionali.</li>
		<li>Trasferire la soluzione lipidica contenente 50 mg di lipidi in un matraccio di evaporazione.</li>
		<li>Utilizzando un evaporatore rotante, far evaporare il solvente e distribuire uniformemente il lipide sulla parete del fondo del pallone per formare un sottile film di lipidi.</li>
		<li>Mettere il pallone in un essiccatore sottovuoto e lasciarlo sotto pressione negativa per una notte per rimuovere completamente il solvente.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di traslazione al matraccio di evaporazione. Ruotare il matraccio per distribuire il tampone sul sottile film lipidico. Incubare per 5 minuti per idratare il film.</li>
		<li>Sonicare il pallone con un omogeneizzatore ad ultrasuoni o un pulitore ad ultrasuoni. Cambiare di tanto in tanto l'angolazione del matraccio per consentire alla soluzione di toccare completamente la pellicola. Assicurarsi che il sottile film lipidico venga staccato dal fondo ed emulsionato in modo completo e omogeneo. NOTA: La micrografia elettronica dei lipidi biotinilati contenenti liposomi è mostrata nella Figura 1.</li>
		<li>Trasferire la sospensione liposomica (50 mg lipidi/ml) in un nuovo tubo da 1,5 ml. Se non deve essere utilizzato immediatamente, congelare i liposomi in azoto liquido e conservare a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Traduzione in vitro
<ol><li>Scongelare rapidamente l'estratto di germe di grano facendo galleggiare i tubi sull'acqua a temperatura ambiente per alcuni minuti. Dopo lo scongelamento, mescolare immediatamente delicatamente capovolgendo i tubi, girare verso il basso e raffreddare sul ghiaccio fino all'uso. NOTA: Congelare l'estratto di germe di grano in azoto liquido dopo l'uso e conservare a -80 °C. Resiste a diversi cicli di congelamento/scongelamento.</li>
	<li>Scongelare 20 mg/mL di soluzione madre di creatinchinasi. Miscelare 5 μL di soluzione madre e 45 μL di tampone di traduzione per preparare 2 mg/mL di soluzione di lavoro di creatinchinasi. ATTENZIONE: Il ricongelamento della creatinchinasi non è raccomandato.</li>
	<li>Scongelare liposomi o mRNA quando necessario.</li>
	<li>Condurre una traduzione proteica su piccola scala.<ol><li>Rimuovere l'acqua sia dal tubo che dalla coppa di dialisi (0,1 ml), come preparato al punto 3.3.2.</li>
		<li>Iniettare 1 mL e 300 μL di tampone di traslazione rispettivamente nel tubo e nella coppa di dialisi. ATTENZIONE: Nel caso in cui il fondo della coppa di dialisi non raggiunga la superficie del tampone di traslazione nel tubo da 1,5 ml, iniettare altri 50-100 μL di tampone nel tubo.</li>
		<li>Preparare la miscela della reazione di traduzione miscelando 15,6 μL di tampone di traduzione, 2,4 μL di 2 mg/ml di creatina chinasi, 12 μL di 50 mg/ml di liposomi, 15 μL di estratto di germe di grano e 15 μL di mRNA. Mescolare delicatamente capovolgendo i tubi e ruotare verso il basso.</li>
		<li>Aspirare 60 μL della miscela della reazione di traslazione utilizzando una pipetta da 200 μL.</li>
		<li>Inserire la punta della pipetta nella superficie inferiore del tampone di traslazione nella coppa di dialisi. Pipettare la miscela di reazione lentamente e delicatamente. Coprire la coppa di dialisi con un coperchio per evitare l'evaporazione. NOTA: La miscela di reazione affonda naturalmente sul fondo della tazza e forma un doppio strato. Non disturbare il doppio strato mescolando o agitando la tazza.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire una traduzione su larga scala (Figura 1).<ol><li>Versare 22 mL di tampone di traslazione in una provetta da 25 mL. Inserire una coppa di dialisi di grandi dimensioni (2 ml) nel tubo e aggiungere 2 ml di tampone di traslazione nella tazza.</li>
		<li>Preparare una miscela di reazione di traduzione mescolando 130 μL di tampone di traduzione, 20 μL di 2 mg/mL di creatina chinasi, 100 μL di 50 mg/ml di liposoma, 125 μL di estratto di germe di grano e 125 μL di mRNA. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio.</li>
		<li>Aspirare tutta la miscela di reazione di traslazione (500 μL) utilizzando una pipetta da 1.000 μL. Iniettare la miscela della reazione di traslazione nella coppa di dialisi nello stesso modo descritto al punto 5.4.5. Coprire la coppa di dialisi con un coperchio per evitare l'evaporazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare le reazioni a 15 °C per 24 ore.</li>
	<li>Mescolare bene la reazione nella coppa di dialisi mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione grezza di proteoliosoma in un nuovo tubo. NOTA: Si consiglia un tubo piatto da 1,5 ml per raccogliere il proteoliposoma dalla traduzione su piccola scala. Dopo la centrifugazione, i liposomi formano pellet compatto e facilmente visibile nell'angolo inferiore del tubo.</li>
</ol>6. Purificazione dei proteoliposomi
<ol><li>Centrifugare la provetta contenente la sospensione di proteoliosoma grezzo a 17.800 x g a 4 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante. Sospendere il pellet proteoliosoma in PBS (piccola scala: 1 mL, grande scala: 10 ml) mediante pipettaggio.</li>
	<li>Ripetere la centrifugazione e il lavaggio dei proteoliposomi per altri due cerchi.</li>
	<li>Dopo il lavaggio, aggiungere una piccola quantità di PBS e risospendere bene il pellet di proteoliposomia mediante pipettaggio. Misurare il volume della sospensione utilizzando una micro pipetta. Aggiungere PBS per regolare il volume a 60 μL (piccola scala) o 500 μL (grande scala). Trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Trasferire 10 μL di sospensione di proteoliposomia in una nuova provetta PCR per SDS-PAGE. Dividere il resto dei campioni in porzioni più piccole da utilizzare quando necessario. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.</li>
</ol>7. Colorazione SDS-PAGE e CBB
<ol><li>Aggiungere 70 μL di acqua e 40 μL di 3x tampone campione SDS-PAGE a 10 μL di sospensione di proteoliposomi. ATTENZIONE: Non far bollire il campione SDS-PAGE, poiché le proteine di membrana si aggregano e difficilmente penetrano nel gel di acrilammide in elettroforesi. Inoltre, aggiungere abbastanza agente riducente al tampone campione SDS-PAGE (ad esempio, 2-mercaptoetanolo al 3% di concentrazione finale) per prevenire l'ossidazione.</li>
	<li>Impostare un gel SDS-PAGE con gradiente del 5%–20% in una camera di elettroforesi. Carico 3 μL, 6 μL, 12 μL di campioni di proteoliposomi, 2 μL di marcatore di dimensione proteica e serie standard BSA.</li>
	<li>Elettroforesi a 52 mA, 400 V per 30 min.</li>
	<li>Macchiare il gel con colorante CBB per 1 ora. Decolorare in acqua calda e scansionare l'immagine del gel.</li>
	<li>Utilizzando il software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantificare l'intensità della banda della proteina di membrana in ciascuna corsia. Stimare la quantità di proteine di membrana sintetizzate con la serie standard BSA.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato fornisce un metodo per produrre proteine di membrana ad un alto tasso di successo. Questo protocollo è semplice, altamente riproducibile e facile da scalare. Ha anche il potenziale per ridurre i tempi e i costi degli esperimenti che consumano una grande quantità di proteine di membrana. Il metodo di dialisi a doppio strato migliora la produttività di 4-10 volte rispetto al metodo a doppio strato o al metodo di dialisi (Figura 2B)45. In un c...

Le proteine di membrana sono uno dei bersagli farmacologici più importanti nella diagnosi e nella terapia. Infatti, metà dei piccoli farmaci composti bersaglio sono proteine di membrana, come i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e i canali ionici1. Nel corso degli anni, i ricercatori hanno lavorato su studi biochimici, biofisici e strutturali delle proteine di membrana per chiarire la loro struttura e funzione 2,3. Anche lo sviluppo di anticorpi monoclonali contro le proteine di membrana viene eseguito attivamente al fine di accelerare gli studi funzionali e strutturali e sviluppare applicazioni terapeutiche e diagnostiche 4,5,6,7,8,9. Tutti questi studi richiedono una grande quantità di proteine di membrana di alta qualità10. Ad esempio, sono necessari diversi milligrammi di proteine di membrana purificate con conformazione naturale per lo sviluppo di anticorpi. Una quantità molto maggiore di proteine di membrana altamente purificate è necessaria per la cristallografia a raggi X. Tuttavia, la produzione di massa di proteine di membrana rimane un collo di bottiglia nella ricerca sulle proteine di membrana11. Le proteine di membrana hanno strutture complicate con una o più eliche transmembrana e svolgono un ruolo importante nell'omeostasi cellulare. La sovraespressione eterologa delle proteine di membrana porta a molteplici ostacoli come l'aggregazione di proteine di membrana che si accumulano ad alte concentrazioni locali o il disturbo delle vie del segnale cellulare. Anche se l'espressione ha successo, anche le fasi successive della preparazione del campione incontrano difficoltà. Ad esempio, la preparazione del proteoliposoma, richiede competenze di alto livello ed esperienze professionali nella solubilizzazione, purificazione e stabilizzazione delle proteine di membrana, e costa molto sforzo e tempo anche12,13.
D'altra parte, alcune tecnologie avanzate sono emerse negli ultimi decenni per produrre proteine senza l'uso di cellule viventi 14,15,16,17,18. La tecnologia di sintesi proteica priva di cellule ricostituisce la reazione di traduzione in una provetta. Poiché non ci sono limitazioni che il sistema di espressione cellulare ha, i sistemi privi di cellule hanno il potenziale per sintetizzare una varietà di proteine che sono difficili da esprimere o mostrano tossicità nelle cellule. L'estratto cellulare purificato o il macchinario traslazionale ricostituito viene mescolato con mRNA modello, amminoacidi e fonti di energia e le proteine ricombinanti vengono sintetizzate in breve tempo. Per quanto riguarda la sintesi proteica di membrana, alcuni tipi di scaffold composti da lipidi o anfifili, come liposomi, bicelle, nanodischi o copolimeri vengono aggiunti alla reazione cell-free 19,20,21,22,23,24. Le proteine di membrana sintetizzate interagiscono con gli scaffold e possono essere stabilizzate in acqua. Le proteine di membrana sintetizzate prive di cellule sono ampiamente utilizzate negli studi funzionali e nella produzione di anticorpi 25,26,27,28,29,30,31.
In questo protocollo, descriviamo un metodo efficiente di produzione di proteoliposomi senza cellule utilizzando il sistema privo di cellule di grano e liposomi. Il sistema di sintesi proteica senza cellule di grano è un potente sistema di traduzione in vitro che utilizza l'estratto del germe di grano 15,32,33. Il germe di grano contiene una grande quantità di macchinari traslazionali e pochi inibitori della traduzione. Il meccanismo traslazionale nel grano, un membro degli eucarioti, è adatto per tradurre le proteine eucariotiche e la sua efficienza di traduzione è difficilmente influenzata dall'uso del codone del modello mRNA. Utilizzando il sistema privo di cellule di grano, abbiamo sintetizzato una varietà di proteine tra cui protein chinasi 34,35, ubiquitina ligasi36, fattori di trascrizione37 e proteine di membrana con alti tassi di successo. Per la produzione di proteine di membrana, aggiungiamo liposomi di vescicole lipidiche nella miscela di traduzione come scaffold19,38. I domini idrofobici delle proteine di membrana interagiscono con il doppio strato lipidico e sono spontaneamente integrati con il liposoma. La centrifugazione a gradiente di densità viene utilizzata per separare rigorosamente il proteoliosoma dalle proteine endogene del grano, anche se una centrifugazione comune della miscela della reazione di traduzione è sufficiente per una semplice purificazione del proteoliposomia20. Molti tipi di proteine integrali di membrana sono stati sintetizzati utilizzando il sistema privo di cellule di grano e applicati per varie ricerche e sviluppi 25,38,39,40,41,42,43,44. Inoltre, abbiamo sviluppato il "metodo di dialisi a doppio strato" per la produzione su larga scala45,46. In questo metodo, il dispositivo di dialisi a coppa viene immerso nel tampone di alimentazione del substrato e nella tazza si formano due strati di miscela di reazione di traslazione e tampone di alimentazione del substrato, come mostrato nella Figura 1. La fornitura continua di substrati e la rimozione del sottoprodotto possono essere condotte in modo efficiente sia nella parte superiore che in quella inferiore della miscela di reazione per lungo tempo, il che porta a un'eccellente efficacia di traduzione (Figura 2A e Figura 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Le proteine di membrana svolgono ruoli essenziali in una varietà di processi cellulari e svolgono funzioni vitali. Le proteine di membrana sono importanti dal punto di vista medico nella scoperta di farmaci perché sono gli obiettivi di oltre la metà di tutti i farmaci. Un ostacolo alla conduzione di studi biochimici, biofisici e strutturali sulle proteine di membrana e sullo sviluppo di anticorpi è stata la difficoltà di produrre grandi quantità di proteine di membrana di alta qualità con corretta conformazione e attività. Qui descriviamo un "metodo di dialisi a doppio strato" che utilizza un sistema privo di cellule di germe di grano, liposomi e coppette di dialisi per sintetizzare efficacemente le proteine di membrana e preparare proteoliposomi purificati in breve tempo con un alto tasso di successo. Le proteine di membrana possono essere prodotte tanto quanto in diversi milligrammi, come GPCR, canali ionici, trasportatori e tetraspanine. Questo metodo privo di cellule contribuisce a ridurre i tempi, i costi e gli sforzi per la preparazione di proteoliposomi di alta qualità e fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening di bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Utilizzando questo protocollo, i proteoliposomi parzialmente purificati possono essere ottenuti in breve tempo. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Venticinque GPCR di Classe A, B e C sono stati sintetizzati con successo utilizzando il metodo della dialisi a doppio strato (piccola scala) e parzialmente purificati mediante centrifugazione e lavaggio tampone. Sebbene la quantità di proteine sintetizzate vari a seconda del tipo di proteina, da 50 a 400 μg di proteine di...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.6K Views.  Ehime University. Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

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Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Ricerca

Biochimica

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Identificazione delle regioni di proteina funzionale attraverso la proteina chimerica costruzione

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...