Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie z. B. wie werden weiße Blutkörperchen aktiviert und wie entwickeln sich Allergien gegen einzelne Allergene? Der Hauptvorteil dieses robusten und reproduzierbaren Allergiemausmodells besteht darin, dass weniger Mäuse verwendet werden können, um eine geringere Varianz mit einer experimentellen Population zu erzielen. Neue Immuntherapien zur Kontrolle der Immunantworten erfordern robuste Mausmodelle als erstes Mittel zur Prüfung der In-vivo-Wirksamkeit.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich somit auf die Immuntherapie der Allergie. Obwohl diese Methode Einblick in Allergien geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie Autoimmunität, bei der unerwünschte Antikörperreaktionen eine Schlüsselrolle bei Krankheiten spielen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mangelnder Erfahrung in der Arbeit mit liposomalen Nanopartikeln oder einer Unerfahrenheit mit den in der Mausarbeit erforderlichen Techniken schwierigkeiten.
Beginnen Sie mit 2,5 Moläquivalent des heterobifunktionellen Verklinkers zum Protein und platzieren Sie die Reaktion auf einem oszillierenden Shaker bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde. Nach einer einstündigen Inkubation mit SPDP das Protein auf einer Säule, die in 100-Millimolar-Natriumacetat ausgeglichen wird, entsalzen und die Fraktionen sammeln. Bestimmen Sie die Absorptionsfähigkeit von 280 Nanometern und bündeln Sie die oberen Fraktionen.
Waschen Sie die Säule in PBS, und fügen Sie 25-Millimolar Dithiothreitol, oder DTT, zu den gepoolten Proteinfraktionen für eine fünf- bis zehnminütige Inkubation hinzu. Messen Sie dann die 280- und 343-Nanometer-Absorptionen des Proteins, um die Berechnung des Verknüpfungsverhältnisses basierend auf der Molarität des Proteins und des Linkers zu ermöglichen. Führen Sie anschließend die gepoolten Fraktionen der PBS-gewaschenen Säule aus, und sammeln Sie die Fraktionen für die Messung des 280-Nanometer- und oberen Fraction-Poolings, wie gezeigt.
Fügen Sie das entsprechende Volumen von 100x DSPE-PEG2000-Maleimid zum Protein hinzu, um eine 1x, 10-fache molarüberschüssige Endkonzentration mit sanftem Wirbeln zu erreichen. Dann führen Sie die Reaktion über Nacht unter Stickstoff in einem versiegelten Rundbodenkolben. Führen Sie das Protein am nächsten Tag über eine vernetzte Dextran-Gel-Perlensäule und speichern Sie die letzten gepoolten Fraktionen des lipidgebundenen Proteins bei vier Grad Celsius bis zu ihrer Verwendung.
Sobald die richtige Menge jedes Lipids berechnet wurde, kombinieren Sie alle Lipide zu einem 12-Milliliter Borosilikatglas-Reagenzglas und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze und Schläuche, um die Chloroform vorsichtig mit Stickstoff abzublasen. Dann lyophilisieren Sie die Lösung mit 100 Mikroliter DMSO über Nacht. Am nächsten Morgen einen Milliliter Lipid-gebundenes Protein in das 12-Milliliter-Lipidrohr geben und die Lösung drei- bis viermal für 30 bis 60 Sekunden pro Beschallung in einem Beschallungswasserbad mit mindestens fünfminütigen Pausen zwischen den Beschallungen beschallen.
Nach der letzten Beschallung die Probe in eine der in den Extruder gelegten Extruderspritzen laden und die Extruderspritze in das andere Ende des Extruders legen. Die leere Spritze füllt sich, wenn das Lipid durch die Polycarbonat-Membran 0,8 Mikrometer extrudiert wird. Legen Sie den vollständig montierten Extruder in einen Heizblock und drücken Sie den Kolben vorsichtig, um die Spritze zu entleeren.
Nach der letzten Extrusion die Liposomen in eine saubere Durchstechflasche übertragen und die Lipide durch Polycarbonat-0,2- und 0,1-Mikrometer-Membranen extrudieren, wie gerade gezeigt. Dann lagern Sie die Liposomen bei vier Grad Celsius. Um die B-Zell-Reaktion auf die antigene Liposomenaktivierung zu überwachen, setzen Sie 1,5-mal 10 bis zu den siebten Geschnetagen im Calciumfluss-Ladepuffer aus, und fügen Sie 1,5-Mikromolindo-1 zu den Zellen hinzu, wodurch die Lösung in der Röhre mehrmals zum Mischen invertiert wird.
Nach einer 30-minütigen Wasserbad-Inkubation bei 37 Grad Celsius, geschützt vor Licht, fügen Sie das Fünffache des Volumens des Kalziumfluss-Ladepuffers hinzu und zentrieren die Indo-1-markierten Zellen. Für B-Zell-Gating, Fleckenzellen mit Anti-CD5 und Anti-B220-Antikörper in 0,5 Milliliter Ladepuffer bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Zellen in einem frischen Kalziumfluss-Ladepuffer waschen und das Pellet ein bis zwei Mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter frischer Kalziumfluss-Laufpuffer für die Lagerung auf Eis, geschützt vor Licht bis zur Analyse, wieder aufsetzen.
Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter Zellen zu einem gekappten, fünf Milliliter, runden Boden, Polystyrol-Rohr, und erwärmen Sie die Zellen auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Nach drei bis fünf Minuten das Rohr in eine 37-Grad-Celsius-Wasserhülle nen, die mit einem umlaufenden Wasserbad verbunden ist, und führen Sie das Rohr im Wassermantel auf dem Durchflusszytometer. Nach dem Sammeln von 5 000 bis 10.000 Ereignissen pro Sekunde können sich die Zellen 15 bis 30 Sekunden lang stabilisieren und die Datenerfassung erneut starten, indem die Daten mindestens 10 Sekunden lang gesammelt werden, um einen Hintergrundwert zu erstellen.
Bei der 10-Sekunden-Marke entfernen Sie schnell das Rohr aus dem Durchflusszytometer und fügen Sie die entsprechende experimentelle Konzentration antigener Liposomen hinzu. Dann pulsieren Wirbel die Zellen, und lesen Sie die Röhre auf dem Zytometer für weitere drei bis fünf Minuten. Um die Tiere zu sensibilisieren, liefern Sie 200 Mikroliter Erdnussextrakt, der Choleratoxin enthält, per Oralgavage an jeden vier- bis fünf Wochen alten BALB/c weiblichen Mausempfänger einmal pro Woche für drei Wochen und 300 Mikroliter verdünnten Erdnussextrakts in der vierten Woche.
Am 28. Tag bereiten Sie Erdnussextrakt auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter in PBS vor und verwenden Sie ein rektales Thermometer, um die Körpertemperatur jedes sensibilisierten Tieres zu messen. Wenn alle Temperaturen gemessen wurden, verabreichen Sie jedem Empfänger 200 Mikroliter Erdnussextrakt per intraperitonealer Injektion und messen Sie die Körpertemperatur mit dem Rektalthermometer alle 15 Minuten für eine Stunde nach der Injektion. Ein Rückgang der Körpertemperatur deutet auf eine Erdnussallergie hin.
Nachdem Sie Splenozyten von den Erdnuss-allergischen Mäusen isoliert haben, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, die mit einer 27-Spur- und 5/8-Zoll-Nadel ausgestattet ist, um 1,5-mal 10 bis zum siebten der extrahierten allergischen Splenozyten in die Schwanzvenen naiver, nicht entsiver Tiere injiziert zu werden. Einen Tag nach der Adoptivübertragung injizieren Sie intravenös 200 Mikroliter Ara h 2 antigene Liposomen in die Schwanzvene jeder BALB/c-Maus, die die allergischen Splenozyten erhalten hat. Zwei Wochen nach der Liposomeninjektion die Mäuse mit einem i.p.
Injektion von löslichen Ara h 2, gefolgt von einer 200-Mikroliter Ara h 2 Herausforderung am Tag 61. Messen Sie dann die Körpertemperaturen mit der Rektalsonde alle 15 Minuten, wie gezeigt. Die Proteinkonjugation kann durch das Ausführen eines reduzierenden Gels nachgewiesen werden, das eine Zunahme des Molekulargewichts im Vergleich zum nicht konjugierten Protein zeigt.
Um den antigenen liposomenstimulierten B-Zell-Calciumfluss zu bewerten, gate die lebenden Einzelzellen, um die Auswahl der B220-positiven CD5-negativen B-Zellen zu ermöglichen. Das Verhältnis von Indo-1 violett versus Indo-1 blaue Fluoreszenz im Laufe der Zeit kann dann analysiert werden, um die Menge der Liposomen-induzierten B-Zell-Aktivierung zu bewerten. Die Quantifizierung von Ara h 2-spezifischen IgE und IgG1 im Serum von Erdnussextrakt-sensibilisierten Mäusen durch ELISA zeigt, dass Mäuse mit übertragener Empfindlichkeit, die mit Ara h 2 verstärkt werden, messbare Ara h 2-spezifische IgE und IgG1 in ihrem Serum aufweisen.
Die während der Ara h 2-Herausforderung aufgezeichneten Körpertemperaturen zeigen, dass allergische Mäuse nach der Herausforderung verminderte Körpertemperaturen aufweisen, während die Körpertemperaturen bei naiven Mäusen konstant bleiben. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sorgfältig zu verfolgen, wie viel Lipid-gebundenes Protein in die Liposomen eingearbeitet wird, da zu viel Protein die Extrusion erschweren kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Tracking und Sortieren allergenspezifischer B- und T-Zellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie diese allergenspezifischen Zellen auf Therapien reagieren.
Diese Technik wird den Weg für Forscher im Allergiebereich ebnen, um neue Immuntherapien zu erforschen, die allergische Krankheiten mit diesem Mausmodell bekämpfen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Cholera-Toxin gefährlich sein kann und dass die Richtlinien für seine Verwendung gemäß Ihren lokalen institutionellen biologischen Sicherheitsstandards befolgt werden sollten.
