Cette recherche a été soutenue par Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de l’AMED sous le numéro de subvention JP20am0101077. Ce travail a également été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

1. Préparation du plasmide d’expression pEU
REMARQUE : le plasmide d’expression pEU doit inclure le codon de départ, le cadre de lecture ouvert de la protéine membranaire cible et le codon stop dans le fragment (voir Figure 1). Ajouter une ou plusieurs séquences d’étiquettes de détection/purification à l’endroit approprié au besoin. La digestion enzymatique de restriction ou le clonage continu est applicable au sous-clonage. Nous décrivons ici un protocole utilisant une méthode de clonage transparente.
<ol><li>Préparez insérer un fragment d’ADN.<ol><li>Amplifier le gène d’intérêt par PCR en utilisant la matrice d’ADNc, l’amorce 1 et l’amorce 2. L’amorce 1 et l’amorce 2 contiennent des chevauchements de 15 pb pour un clonage homogène, respectivement (voir le tableau des matières). REMARQUE : N’incluez pas les séquences à traiter et à éliminer des protéines matures dans les cellules (p. ex., séquence du signal). Le traitement des protéines synthétisées n’est pas effectué dans un système sans cellules de blé. N’ajoutez pas de séquence Kozak. Le vecteur pEU-E01-MCS possède un amplificateur de traduction E01.</li>
		<li>Ajouter 1/25 volume d’enzyme de restriction DpnI au produit PCR pour éliminer l’ADN plasmidique modèle. Incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Utilisez un kit de purification PCR pour purifier le produit PCR et ajuster la concentration à 20-50 ng / μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Linearize pEU-E01-MCS vectoriel.<ol><li>Effectuer la PCR inverse à l’aide de pEU-E01-MCS, amorce 3 et amorce 4.</li>
		<li>Ajouter 1/25 volume d’enzyme de restriction DpnI au produit de PCR inverse. Incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
		<li>Utilisez un kit de purification PCR pour purifier le produit PCR selon les recommandations du fabricant. Ajuster la concentration à 20–50 ng/μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Mélanger 2 μL de fragment d’ADN inséré, 2 μL de vecteur linéarisé et 4 μL de 2x mélange d’enzymes de clonage sans soudure.</li>
	<li>Transformez la souche JM109 d’Escherichia coli avec le produit de clonage sans soudure. À l’aide d’un épandeur, étaler la suspension bactérienne sur une plaque de gélose LB-ampicilline. REMARQUE: Le vecteur pEU a un marqueur de résistance à l’ampicilline.</li>
	<li>Confirmer la séquence du plasmide d’expression construit à l’aide de l’amorce 5 et de l’amorce 6 du côté 5' et 3' du MCS dans le plasmide pEU, respectivement.</li>
	<li>Amplifier et purifier les plasmides d’expression.<ol><li>Culture de la souche JM109 d’E. coli transformée en plasmide dans 150 mL de milieu LB-ampicilline à 37 °C et 125 coups par minute en agitant pendant la nuit.</li>
		<li>Extraire et purifier les plasmides à l’aide d’un kit midi de préparation de plasmide disponible dans le commerce. Dissoudre les plasmides dans 500 μL de tampon TE. ATTENTION : N’utilisez pas de mini kit de préparation pour l’extraction plasmidique. Il ne fournit pas une qualité et une quantité suffisantes de plasmide.</li>
		<li>Ajouter 500 μL d’alcool phénol/chloroforme/isoamylique (25:24:1). Mélanger vigoureusement pendant 5 min, et centrifuger pendant 5 min à 17 800 x g et à température ambiante. Transférer la solution plasmidique supérieure dans un nouveau tube. ATTENTION : Portez des gants jetables pour protéger la peau du phénol et du chloroforme. REMARQUE: Afin d’éliminer la contamination de la RNase du kit d’extraction plasmidique, purifier les plasmides en utilisant la purification phénol-chloroforme.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de chloroforme pour éliminer complètement le phénol. Mélanger vigoureusement pendant 5 min, et centrifuger pendant 5 min à 17 800 x g et à température ambiante. Transférer la solution plasmidique supérieure dans un nouveau tube.</li>
		<li>Ajouter 2,5 volume d’éthanol et 1/8 volume d’acétate d’ammonium 7,5 M et conserver à -30 °C pendant 1 h.</li>
		<li>Centrifuger à 17 800 x g à 4 °C pendant 10 min. Lavez la pastille avec 500 μL d’éthanol à 70 %. Retirer délicatement le surnageant et laisser sécher la pastille pendant 5 minutes.</li>
		<li>Dissoudre complètement les plasmides d’expression dans 100 μL d’eau ultrapure. Mesurer la concentration de plasmides avec une absorbance à 260 nm. Ajuster la concentration à 1 mg/mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transcription in vitro
ATTENTION : Utilisez des tubes et des embouts en plastique sans DNase et sans nucléase dans les étapes de transcription et de traduction. Évitez d’autoclaver les articles en plastique pour éviter toute contamination.
<ol><li>Récoltez de l’eau ultrapure dans un nouveau tube en plastique. ATTENTION : N’utilisez pas d’eau traitée au DEPC car le DEPC résiduel inhibe fortement la réaction. Utilisez de l’eau ultrapure fraîchement purifiée pour la transcription et la traduction.</li>
	<li>Préparer le mélange réactionnel de transcription en mélangeant 115,2 μL d’eau ultrapure, 40 μL de tampon de transcription LM, 20 μL de mélange NTP, 2,4 μL d’inhibiteur de RNase 80 U/μL, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polymérase et 20 μL de plasmides d’expression pEU de 1 mg/mL. Mélanger doucement les réactifs en les retournant. Effectuez un tour rapide.</li>
	<li>Incuber la réaction de transcription à 37 °C pendant 6 h.</li>
	<li>Mélangez doucement la réaction en inversant et tournez rapidement vers le bas. Utilisez-le immédiatement pour la traduction, sinon congelez-le et conservez-le à -80 °C.</li>
	<li>Confirmer le produit de transcription par électrophorèse.<ol><li>Mélanger 100 mL de 1x tampon TAE et 1 g d’agarose. Chauffer la suspension dans un four à micro-ondes pour préparer le gel TAE d’agarose à 1%.</li>
		<li>Prendre 1 μL de réaction de transcription et mélanger avec 3 μL d’eau et 4 μL de colorant de charge 2x. REMARQUE: La dénaturation de l’ARN n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Charger 4 μL du mélange et 2 μL de marqueur d’échelle d’ADN sur le gel TAE d’agarose.</li>
		<li>Électrophorèse à 100 V pendant 20 min.</li>
		<li>Colorer le gel dans du bromure d’éthidium pendant 30 min. Vérifiez le diagramme de bande d’échelle de l’ARNm à l’aide d’un transilluminateur UV et d’un imageur de gel. NOTE: Lorsqu’une bande tachée de moins de 500 pb est observée, une dégradation de l’ARNm est suspectée.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Préparation des documents à traduire
<ol><li>Préparez le tampon de traduction.<ol><li>Mélanger 27 mL d’eau ultrapure fraîchement préparée et 0,75 mL de chaque solution mère 40x pour S1, S2, S3 et S4, respectivement dans un tube de 50 mL. REMARQUE: Modulez les quantités de matériaux en fonction de la quantité finale requise de tampon de traduction 1x. ATTENTION : Ne conservez pas ou ne recongelez pas l’excès de tampon de traduction 1x après utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer la solution mère de créatine kinase. Dissoudre la créatine kinase lyophilisée dans de l’eau ultrapure jusqu’à une concentration finale de 20 mg/mL. Distribuer la solution en petites quantités (10 à 50 μL chacun) dans des tubes PCR à 8 bandes de 0,2 mL. Congeler les tubes dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C. ATTENTION : Ne pas recongeler la solution de créatine kinase après la décongélation.</li>
	<li>Lavez les gobelets de dialyse (format 0,1 mL) pour éliminer le glycérol de la membrane de dialyse. REMARQUE: Il existe plusieurs tasses de dialyse de différentes tailles. Des gobelets de petite taille (0,1 mL) sont utilisés pour les essais à petite échelle (section 5.4) et des gobelets de grande taille (2 mL) pour la production à grande échelle (section 5.5), respectivement. L’étape de lavage de la membrane de dialyse des tasses de grande taille est évitable.<ol><li>Mettez 1 mL d’eau ultrapure dans un nouveau tube de 1,5 mL. Insérez une tasse de dialyse de petite taille (0,1 ml) dans le tube. Ajouter 0,5 ml d’eau ultrapure dans la tasse.</li>
		<li>Incuber pendant plus de 30 min à température ambiante.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Préparation des liposomes
NOTE: Nous décrivons ici deux protocoles pour la préparation des liposomes. L’un utilise des liposomes lyophilisés prêts à l’emploi (rubrique 4.1), tandis que l’autre produit des liposomes en hydratant un film lipidique mince (rubrique 4.2).
<ol><li>Préparer les liposomes en utilisant des liposomes lyophilisés. REMARQUE: Un moyen plus facile de produire du protéoliposome est d’utiliser un liposome d’asolectine disponible dans le commerce. L’asolectine est une sorte de lipide naturel extrait du soja.<ol><li>Ouvrez le flacon contenant 10 mg de liposomes d’asolectine lyophilisés (voir le tableau des matières) et ajoutez 200 μL de tampon de traduction (rubrique 3.1) au fond du flacon. Sceller le flacon et incuber pendant 10 min.</li>
		<li>Mélanger vigoureusement en mettant le flacon sur le mélangeur vortex pendant 1 min.</li>
		<li>Insérez le flacon dans un tube de 50 mL. Faire tourner le tube en centrifugeant à 500 x g pendant 1 min.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette, transférer la suspension de liposomes d’asolectine (50 mg de lipides/mL) dans un nouveau tube de 1,5 mL. Utilisez immédiatement le liposome pour la traduction, sinon congelez dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez les liposomes en hydratant un mince film lipidique.<ol><li>Si un lipide est vendu sous forme de poudre, dissoudre dans du chloroforme ou un solvant organique approprié à une concentration de 10 à 100 mg/mL. NOTE: Un film lipidique mince peut être préparé en utilisant des lipides amphiphiles purifiés et / ou synthétisés. La méthode de purification de l’asolectine est décrite précédemment38. Des lipides fonctionnellement modifiés, tels que les lipides biotinylés, les lipides fluorescents et les lipides adjuvants, peuvent être ajoutés aux lipides basaux pour produire des liposomes fonctionnels.</li>
		<li>Transvaser la solution lipidique contenant 50 mg de lipide(s) dans une fiole d’évaporation.</li>
		<li>À l’aide d’un évaporateur rotatif, évaporer le solvant et répartir uniformément le lipide sur la paroi du fond du ballon pour former une fine pellicule de lipides.</li>
		<li>Mettre la fiole dans un dessiccateur sous vide et laisser sous pression négative pendant une nuit pour éliminer complètement le solvant.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon de translation dans la fiole d’évaporation. Faire pivoter la fiole pour étaler le tampon sur le film lipidique mince. Incuber pendant 5 min pour hydrater le film.</li>
		<li>Soniquer le ballon avec un homogénéisateur à ultrasons ou un nettoyeur à ultrasons. Modifier l’angle de la fiole de temps en temps pour permettre à la solution de toucher complètement le film. Assurez-vous que le film lipidique mince est pelé par le bas et émulsionné de manière complète et homogène. NOTE: La micrographie électronique des lipides biotinylés contenant des liposomes est illustrée à la figure 1.</li>
		<li>Transférer la suspension de liposomes (50 mg de lipides/mL) dans un nouveau tube de 1,5 mL. S’il ne doit pas être utilisé immédiatement, congeler les liposomes dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Traduction in vitro
<ol><li>Décongeler rapidement l’extrait de germe de blé en faisant flotter les tubes sur de l’eau à température ambiante pendant quelques minutes. Après la décongélation, mélanger immédiatement doucement en retournant les tubes, tourner vers le bas et refroidir sur la glace jusqu’à utilisation. NOTE: Congeler l’extrait de germe de blé dans de l’azote liquide après utilisation et conserver à -80 °C. Il résiste à plusieurs cycles de gel/dégel.</li>
	<li>Décongeler 20 mg/mL de solution mère de créatine kinase. Mélanger 5 μL de solution mère et 45 μL de tampon de traduction pour préparer une solution de travail de créatine kinase à 2 mg/mL. ATTENTION : La recongélation de la créatine kinase n’est pas recommandée.</li>
	<li>Décongeler les liposomes ou les ARNm au besoin.</li>
	<li>Effectuer une traduction de protéines à petite échelle.<ol><li>Retirer l’eau du tube et de la tasse de dialyse (0,1 mL), tel que préparé à l’étape 3.3.2.</li>
		<li>Injecter 1 mL et 300 μL de tampon de traduction dans le tube et la tasse de dialyse, respectivement. ATTENTION : Si le fond de la tasse de dialyse n’atteint pas la surface du tampon de translation dans le tube de 1,5 mL, injectez 50 à 100 μL supplémentaires de tampon dans le tube.</li>
		<li>Préparer le mélange réactionnel de translation en mélangeant 15,6 μL de tampon de traduction, 2,4 μL de créatine kinase à 2 mg/mL, 12 μL de liposomes à 50 mg/mL, 15 μL d’extrait de germe de blé et 15 μL d’ARNm. Mélanger doucement en inversant les tubes et tourner vers le bas.</li>
		<li>Aspirer 60 μL du mélange de réaction de translation à l’aide d’une pipette de 200 μL.</li>
		<li>Insérez l’embout de la pipette dans la surface inférieure du tampon de translation dans la cuvette de dialyse. Éjecter à la pipette le mélange réactionnel lentement et doucement. Couvrir la tasse de dialyse avec un couvercle pour éviter l’évaporation. REMARQUE: Le mélange réactionnel coule naturellement au fond de la tasse et forme une bicouche. Ne dérangez pas la bicouche en mélangeant ou en secouant la tasse.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une traduction à grande échelle (Figure 1).<ol><li>Verser 22 mL de tampon de translation dans un tube de 25 mL. Insérez une tasse de dialyse de grande taille (2 ml) dans le tube et ajoutez 2 ml de tampon de traduction dans la tasse.</li>
		<li>Préparer un mélange réactionnel de translation en mélangeant 130 μL de tampon de traduction, 20 μL de créatine kinase à 2 mg/mL, 100 μL de liposomes à 50 mg/mL, 125 μL d’extrait de germe de blé et 125 μL d’ARNm. Mélanger doucement par pipetage.</li>
		<li>Aspirer tout le mélange de réaction de translation (500 μL) à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Injecter le mélange de réaction de translation dans la coupelle de dialyse de la même manière que celle décrite à l’étape 5.4.5. Couvrir la tasse de dialyse avec un couvercle pour éviter l’évaporation.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber les réactions à 15 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Bien mélanger la réaction dans la tasse de dialyse en pipetant. Transférer la suspension brute de protéoliposomes dans un nouveau tube. REMARQUE : Un tube à fond plat de 1,5 mL est recommandé pour recueillir le protéoliposome à partir de la traduction à petite échelle. Après centrifugation, les liposomes forment des pastilles compactes et facilement visibles sur le coin inférieur du tube.</li>
</ol>6. Purification des protéoliposomes
<ol><li>Centrifuger le tube contenant la suspension brute de protéoliposomes à 17 800 x g à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant. Suspendre la pastille de protéoliposome dans du PBS (petite échelle : 1 mL, grande échelle : 10 mL) par pipetage.</li>
	<li>Répétez la centrifugation et le lavage des protéoliposomes pour deux autres cercles.</li>
	<li>Après le lavage, ajouter une petite quantité de PBS et bien remettre en suspension la pastille de protéoliposome par pipetage. Mesurer le volume de suspension à l’aide d’une micropipette. Ajouter du PBS pour ajuster le volume à 60 μL (petite échelle) ou 500 μL (grande échelle). Transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Transférer 10 μL de suspension de protéoliposomes dans un nouveau tube PCR pour SDS-PAGE. Diviser le reste des échantillons en plus petites portions pour les utiliser au besoin. Congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.</li>
</ol>7. FDS-PAGE et coloration CBB
<ol><li>Ajouter 70 μL d’eau et 40 μL de tampon d’échantillon SDS-PAGE 3x à 10 μL de suspension de protéoliposome. ATTENTION : Ne pas faire bouillir l’échantillon SDS-PAGE, car les protéines membranaires s’agrègent et pénètrent à peine dans le gel d’acrylamide en électrophorèse. De plus, ajouter suffisamment d’agent réducteur au tampon d’échantillon SDS-PAGE (p. ex. 2-mercaptoéthanol à 3 % de concentration finale) pour prévenir l’oxydation.</li>
	<li>Réglez un gel SDS-PAGE à gradient de 5 % à 20 % dans une chambre d’électrophorèse. Charge 3 μL, 6 μL, 12 μL d’échantillons de protéoliposomes, 2 μL de marqueur de taille de protéine et série standard BSA.</li>
	<li>Électrophorèse à 52 mA, 400 V pendant 30 min.</li>
	<li>Colorer le gel avec du colorant CBB pendant 1 h. Décolorer dans l’eau chaude et scanner l’image du gel.</li>
	<li>À l’aide du logiciel NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantifier l’intensité de la bande de protéines membranaires dans chaque voie. Estimer la quantité de protéines membranaires synthétisées avec la série standard BSA.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté fournit une méthode de production de protéines membranaires à un taux de réussite élevé. Ce protocole est simple, hautement reproductible et facile à mettre à l’échelle. Il a également le potentiel de réduire le temps et le coût des expériences qui consomment une grande quantité de protéines membranaires. La méthode de dialyse bicouche améliore la productivité de 4 à 10 fois par rapport à la méthode bicouche ou à la méthode de dialyse (Figure 2B</stron...

Les protéines membranaires sont l’une des cibles médicamenteuses les plus importantes dans le diagnostic et la thérapeutique. En effet, la moitié des petits médicaments composés ciblés sont des protéines membranaires, telles que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et les canaux ioniques1. Au fil des ans, les chercheurs ont travaillé sur des études biochimiques, biophysiques et structurales des protéines membranaires afin d’élucider leur structure et leur fonction 2,3. Le développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines membranaires est également réalisé activement afin d’accélérer les études fonctionnelles et structurelles et de développer des applications thérapeutiques et diagnostiques 4,5,6,7,8,9. Toutes ces études nécessitent une grande quantité de protéines membranaires de haute qualité10. Par exemple, plusieurs milligrammes de protéines membranaires purifiées avec une conformation naturelle sont nécessaires pour le développement d’anticorps. Une quantité beaucoup plus importante de protéines membranaires hautement purifiées est nécessaire pour la cristallographie aux rayons X. Cependant, la production de masse de protéines membranaires reste un goulot d’étranglement dans la recherche sur les protéines membranaires11. Les protéines membranaires ont des structures compliquées avec une ou plusieurs hélices transmembranaires et jouent un rôle important dans l’homéostasie cellulaire. La surexpression hétérologue des protéines membranaires entraîne de multiples obstacles tels que l’agrégation des protéines membranaires qui s’accumulent à des concentrations locales élevées ou la perturbation des voies de signal cellulaire. Même si l’expression est réussie, les étapes ultérieures de la préparation de l’échantillon rencontrent également des difficultés. Par exemple, la préparation du protéoliposome nécessite des compétences de haut niveau et des expériences professionnelles en solubilisation, purification et stabilisation des protéines membranaires, et coûte beaucoup d’efforts et de temps12,13.
D’autre part, certaines technologies de pointe ont émergé au cours des dernières décennies pour produire des protéines sans l’utilisation de cellules vivantes 14,15,16,17,18. La technologie de synthèse des protéines acellulaires reconstitue la réaction de traduction dans un tube à essai. Comme il n’y a pas de limites que le système d’expression cellulaire a, les systèmes acellulaires ont le potentiel de synthétiser une variété de protéines qui sont difficiles à exprimer ou qui montrent une toxicité dans les cellules. L’extrait cellulaire purifié ou la machinerie translationnelle reconstituée est mélangé avec des ARNm modèles, des acides aminés et des sources d’énergie, et les protéines recombinantes sont synthétisées en peu de temps. En ce qui concerne la synthèse des protéines membranaires, certains types d’échafaudages composés de lipides ou d’amphiphiles, tels que les liposomes, les bicelles, les nanodisques ou les copolymères sont ajoutés à la réaction acellulaire 19,20,21,22,23,24. Les protéines membranaires synthétisées interagissent avec les échafaudages et peuvent être stabilisées dans l’eau. Les protéines membranaires synthétisées acellulaires sont largement utilisées dans les études fonctionnelles et la production d’anticorps 25,26,27,28,29,30,31.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode efficace de production de protéoliposomes sans cellules utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Le système de synthèse protéique acellulaire du blé est un puissant système de traduction in vitro utilisant l’extrait de germe de blé 15,32,33. Le germe de blé contient une grande quantité de machinerie translationnelle et peu d’inhibiteurs de la traduction. La machinerie translationnelle du blé, un membre des eucaryotes, convient à la traduction des protéines eucaryotes, et son efficacité de traduction n’est guère affectée par l’utilisation du codon de l’ARNm modèle. En utilisant un système sans cellules de blé, nous avons synthétisé une variété de protéines, y compris les protéines kinases 34,35, l’ubiquitine ligases36, les facteurs de transcription37 et les protéines membranaires avec des taux de réussite élevés. Pour la production de protéines membranaires, nous ajoutons le liposome des vésicules lipidiques dans le mélange de traduction sous forme d’échafaudage19,38. Les domaines hydrophobes de la protéine membranaire interagissent avec la bicouche lipidique et sont spontanément intégrés aux liposomes. La centrifugation par gradient de densité est utilisée pour séparer strictement le protéoliposome des protéines endogènes du blé, même si une centrifugation commune du mélange réactionnel de translation est suffisante pour une simple purification du protéoliposome20. De nombreux types de protéines membranaires intégrales ont été synthétisés à l’aide d’un système sans cellules de blé et appliqués pour diverses recherches et développements 25,38,39,40,41,42,43,44. De plus, nous avons développé la « méthode de dialyse bicouche » pour la production à grande échelle45,46. Dans cette méthode, un dispositif de dialyse de type tasse est immergé dans le tampon d’alimentation du substrat, et deux couches de mélange de réaction de translation et de tampon d’alimentation de substrat sont formées dans la tasse, comme illustré à la figure 1. L’approvisionnement continu en substrats et l’élimination du sous-produit peuvent être effectués efficacement en haut et en bas du mélange réactionnel pendant une longue période, ce qui conduit à une excellente efficacité de traduction (Figure 2A et Figure 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Les protéines membranaires jouent un rôle essentiel dans une variété de processus cellulaires et remplissent des fonctions vitales. Les protéines membranaires sont médicalement importantes dans la découverte de médicaments, car elles sont la cible de plus de la moitié de tous les médicaments. Un obstacle à la réalisation d’études biochimiques, biophysiques et structurelles des protéines membranaires ainsi que du développement d’anticorps a été la difficulté de produire de grandes quantités de protéines membranaires de haute qualité avec une conformation et une activité correctes. Nous décrivons ici une « méthode de dialyse bicouche » utilisant un système sans cellules germinales de blé, des liposomes et des tasses de dialyse pour synthétiser efficacement les protéines membranaires et préparer des protéoliposomes purifiés en peu de temps avec un taux de réussite élevé. Les protéines membranaires peuvent être produites autant que dans plusieurs milligrammes, telles que les RCPG, les canaux ioniques, les transporteurs et les tétraspanines. Cette méthode acellulaire contribue à réduire le temps, le coût et les efforts nécessaires à la préparation de protéoliposomes de haute qualité et fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage de cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

En utilisant ce protocole, des protéoliposomes partiellement purifiés peuvent être obtenus en peu de temps. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A. Vingt-cinq RCPG de classe A, B et C ont été synthétisés avec succès en utilisant la méthode de dialyse bicouche (à petite échelle) et partiellement purifiés par centrifugation et lavage tampon. Bien que la quantité de protéines synthétisées varie selon le type de protéine, 50 à 400 μg de protéines memb...

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Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Ce protocole décrit une méthode efficace sans cellules pour la production de protéoliposomes de haute qualité par dialyse bicouche utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Cette méthode fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage des cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

Production acellulaire de protéoliposomes pour l’analyse fonctionnelle et le développement d’anticorps ciblant les protéines membranaires

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.6K vues.  Ehime University. Ce protocole décrit une méthode efficace sans cellules pour la production de protéoliposomes de haute qualité par dialyse bicouche utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Cette méthode fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage des cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

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Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Bacterial Affichage intérieur-membrane pour le criblage d&#39;une bibliothèque de fragments d&#39;anticorps

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Recherche

Biochimie

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

L&#39;échelle du laboratoire: Production et purification d&#39;un anticorps thérapeutique

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Sans tensioactifs ultrarapide Reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques à l’aide de fusogène complémentaire chargée protéoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Identification d’une protéine fonctionnelle des régions par le biais de Construction des protéines chimériques

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...