Unser Protokoll stellt eine hocheffiziente und leicht reproduzierbare Methode zur Quantifizierung einzelsträngiger DNA dar, die ein Marker für Replikationsstress in einer Vielzahl von Zelllinien ist. Darüber hinaus ermöglicht seine Einfachheit Anwendungen und Bildschirme mit hohem Durchsatz. Insbesondere ermöglicht diese Methode eine schnelle Quantifizierung eines Replikationsstresses, ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten.
Es ist auch für eine automatische Host-Analysesoftware geeignet, was die Effizienz weiter steigert. Einzelsträngige DNA wird jetzt aktiv als Biomarker für das Ansprechen auf eine Chemotherapie in Betracht gezogen, die auf DNA-Reparaturwege abzielt. Daher ist diese Methode in diesem Szenario sehr gut anwendbar.
Replikationsstress existiert jenseits von Eierstockkrebskontexten oder BRCA1- und BRCA2-defizienten Krebsarten. Und so kann diese Methode auf eine Vielzahl anderer Zelltypen oder Krankheitskontexte angewendet werden. Stellen Sie zunächst polylysinbeschichtete Deckgläser her, indem Sie autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern und Polylysinlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben und 15 Minuten lang auf eine Wippe legen.
Saugen Sie die Lösung auf einer Gewebekulturhaube ab. Waschen Sie die Deckgläser mit sterilem Wasser und legen Sie das Röhrchen mit den Deckgläsern fünf Minuten lang wieder auf die Wippe. Nach dreimaligem Waschen der Deckgläser Wasser aus dem Röhrchen absaugen und die Deckgläser auf einer sterilen Schale verteilen.
Saugen Sie das restliche Wasser ab und lassen Sie es eine Stunde lang in der Gewebekulturhaube trocknen oder bis keine Wassertropfen mehr vorhanden sind. Verschließen Sie die Schale nach dem Trocknen mit Parafilm und stellen Sie sie auf 4 Grad Celsius. Um zu verhindern, dass sich die Zellen während des Vorextraktionsschritts von den Deckgläsern lösen, legen Sie ein polylysinbeschichtetes Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.
Sobald die OVCAR3-Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium von der Platte ab und waschen Sie die Zellen mit 5 bis 7 Millilitern PBS. Saugen Sie das PBS von der Platte ab. Fügen Sie nach dem Absaugen des PBS 1 Milliliter 0,25% Trypsin hinzu und stellen Sie die Schale 8 bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator oder bis sich die Zellen vom Boden der Platte abheben.
Sammeln Sie die Zellen mit 5 bis 10 Millilitern Medium und geben Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Standardverfahren. Als nächstes verdünnen Sie die Zellsuspension und erhalten Sie eine Zahl, die nach drei Populationen 70 bis 80% Konfluenz ergibt.
Fügen Sie 1 Milliliter Zellsuspension auf Polylysin-Deckgläser hinzu, die in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gegeben werden, und züchten Sie die Zellen im Kulturmedium unter Standardbedingungen. Nach einer Populationsverdopplung werden die vorhandenen Medien von der Platte abgesaugt und die Zellen mit 10 mikromolaren IdU für die beiden nachfolgenden Populationsverdopplungen gepulst. Um die Zellen zu ernten, ersetzen Sie das Medium fünf Minuten lang durch eiskaltes 0,5%PBSTx auf Eis.
Zur Fixierung der Zellen PBSTx absaugen und die Zellen 15 Minuten lang mit 3% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie die Zellen nach drei bis vier Wäschen mit PBS bis zur weiteren Verwendung bei 4 Grad Celsius. Nach der Fixierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% PBSTx fünf Minuten lang auf Eis und stellen Sie sicher, dass das gesamte Deckglas bedeckt ist.
Nachdem Sie die Zellen drei- bis viermal mit 1 Milliliter 0,2% PBST bei Raumtemperatur gewaschen haben, saugen Sie das PBST ab und blockieren Sie die Proben mit 5% BSA aus PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie für die Immunfärbung eine einheitliche Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Papiertuch auf eine Tupperware mit flachem Boden legen. Decken Sie den 24-Well-Plattendeckel mit Parafilm ab.
Legen Sie es in die befeuchtete Kammer und legen Sie die Deckgläser auf den Tellerdeckel. Fügen Sie 60 Mikroliter verdünnten primären Anti-BrdU-Maus-Antikörper auf die Oberseite des Deckglases hinzu. Um das Austrocknen des Antikörpers zu verringern und weniger Volumen zu verbrauchen, geben Sie alternativ einen Tropfen verdünnten Antikörper auf den Parafilm und drehen Sie das Deckglas darauf.
Dann eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den primären Antikörper absaugen. Legen Sie die Deckgläser wieder auf eine 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2 % PBST.
Fügen Sie verdünnten sekundären Antikörper auf das Deckglas hinzu, wie zuvor gezeigt, und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Beschriften Sie einen Objektträger und montieren Sie das Deckglas mit DAPI-Einhängemedium auf die Objektträger. Lagern Sie Objektträger 24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, wenn das Montagemedium ausgehärtet oder gehärtet werden muss.
Die Kerne, die aus den unbehandelten und behandelten Zellen mit 0,5 Millimolar Hydroxyharnstoff stammten, wurden in den DAPI- und IdU-Kanälen gefärbt und identifizierbar. Die Analyse dieser Bilder besteht darin, die Anzahl der Herde in jedem Kern zu quantifizieren. Die Anzahl der Herde ist proportional zum Grad der Replikationsspannung.
Es ist wichtig, die Verdopplungszeit der Zelllinie der Wahl zu berücksichtigen, da die Zeit des IdU-Pulsierens für längere oder kürzere Verdopplungszeiträume variieren kann. Alternativ können wir Zellen auf Replikationsprotein A untersuchen, um die Ergebnisse zu bestätigen und verschiedene Replikationsstressreaktionen in Zellen zu bewerten. Diese Technik wird für viele Zelllinien zusammen mit einem DNA-Schadens-induzierenden Mittel verwendet, um die Anhäufung von einfach gespannter DNA zu untersuchen.
Somit ist diese Methode allgemein zugänglich und anwendbar.
