Metastasierung ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle. Dieses Phänomen tritt auf, wenn sich Krebszellen vom Primärtumor lösen, in den Blutkreislauf gelangen, um schließlich ein entferntes Zielorgan zu erreichen. Sobald diese abgelösten Zellen in das Blut gelangen, nennen wir sie sekundäre Tumorzellen.
Sie stellen ein variables Material dar, weil sie einerseits der Hauptschuldige für die Metastasenbildung sind und andererseits einfacher sind als Tumorbiopsien. In der Tat können sie durch eine einfache Blutpunktion gesammelt werden. Trotz der geringen Anzahl dieser Zellen in der Blutprobe sind wir die ersten, die mehrere zirkulierende Tumorzelllinien aus dem Blut des Patienten mit größerer Besorgnis unter Verwendung der 3D-kontrollierten Bedingung herstellen.
Diese Zelllinie kann an jeder kommerziellen Zelllinie für Routineexperimente verwendet werden. Zum Beispiel für das genetische Wirkstoff-Screening, für Proteine von Interesse, aber auch für In-vivo-Experimente, um die Tumorinitiierungskapazität und ihr metastatisches Potenzial zu testen. CTC, zirkulierende Tumorzelllinien, sollten unter 3D-Bedingungen bei Hypoxie kultiviert werden.
Sobald CTC Kugeln gebildet hat, können wir es in das Medium geben und es für fünf Minuten bei 300 RCF zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter Accumax hinzu. Wir suspendieren eine und inkubieren die Lösung 20 Minuten bei 37 Grad.
Dann dissoziierte Kugeln mit PBS waschen und die Zellen pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit einem frisch ergänzten DMEM/F12 und sehen Sie die Zellen mit der Dichte von fünf Zellen pro Mikroliter in einer neuen 24 Low Attachment Platte. Zentrifugen-CTCs-Kugeln eliminieren den Überstand und waschen das Pellet zweimal mit PBS.
Bei 500 Mikroliter PFE gut mischen und die Tube 20 Minuten auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die festen Kugeln und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS, wodurch das maximale Volumen von PBS eliminiert wird, und fügen Sie 20 Mikroliter gebildetes HistoGel hinzu. Nehmen Sie es zur Suspension und machen Sie einen Tropfen auf die Kulturvase, lassen Sie es für 10 Minuten trocknen und lösen Sie es mit einem Skalpell.
Sie können jetzt für jedes gewünschte zu CTCs verarbeiten, die auf ein gewünschtes Protein von Interesse abzielen. Sammeln Sie CTCs und trennen Sie die Kugeln mit Accumax, wie zuvor beschrieben. Eliminieren Sie den Accumax und resuspenieren Sie das Pellet mit drei ml Blockpuffer und übertragen Sie die Suspension durch ein 14 Mikrometer großes Zellsieb, um eine Einzelzelllösung zu erhalten.
Zählen Sie die Zellen und versenden Sie sie in Röhrchen und fügen Sie ein Volumen von 200.000 Zellen hinzu, zentrifugieren Sie die Röhrchen und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie gemäß dem Antikörperdatenblatt in einem Röhrchen das gewünschte Volumen des Antikörpers und in einem anderen Röhrchen seinen Isotyp hinzu und setzen Sie die Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Das verbleibende Röhrchen wird nicht gekennzeichnet und die Verwendung eines Rentabilitätsmarktes wird in diesem Experiment dringend empfohlen.
Beginnen Sie auf dem Zytometer mit der nicht markierten Röhre, um die Spannung im negativ markierten Bereich einzustellen. Platzieren Sie anschließend das Isotyp-Röhrchen. Der Isotyp würde als Negativkontrolle dienen, um zwischen dem positiven Signal und dem unspezifischen Signal zu unterscheiden.
Und beenden Sie das Experiment mit den markierten Zellen mit dem Antikörper von Interesse, wo Sie eine Verschiebung im positiv markierten Tor sehen sollten, wenn das Protein von Interesse exprimiert wird. Diese suspendiert dissoziierte CTCs in ergänztem Medium bei einer Dichte von 200.000 Zellen pro ml. In einem Ultra Low Aufsatz 96, Brunnenplatte, versiegeln Sie das Volumen von 50 Mikroliter und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden bei Hypoxie.
Fügen Sie am nächsten Tag 50 Mikroliter mit unterschiedlicher Konzentration des getesteten Arzneimittels hinzu und fügen Sie das gleiche Volumen von DMEM / F12 hinzu, nur um die Basis der zellulären Lebensfähigkeit weiter zu bestimmen und die Platte für weitere 48 Stunden zu inkubieren. Am dritten Tag rekonstituieren Sie das Mittel und geben Sie 70 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte für 20 Minuten auf einen Orbitalschüttler und messen Sie dann die Lumineszenz.
Dieser Assay ist ein nützliches Werkzeug, um eine große Anzahl von Medikamenten zu testen, um ihre Auswirkungen auf das Zellwachstum von CTC zu bewerten. In Eppendorf resuspend Zellen in 100 Mikroliter PBS kneifen die Haut auf dem Rücken der Maus und führen die Nadel unter die Haut ein. Injizieren Sie langsam das gesamte Volumen an der gleichen Stelle und überwachen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag und opfern Sie die Mäuse, wenn der Tumor eine Größe von 1,5 Kubikzentimetern überschreitet.
Vor der Operation subkutan ein Schmerzmittel injizieren, an der dorsalen ventralen Seite der Maus, machen Sie einen kleinen Schnitt unterhalb der 10. Rippe. Heben Sie die Milz vorsichtig heraus und legen Sie sie auf eine sterile Gaze. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze 50 Mikroliter resuspendierte CTCs in PBS und warten Sie drei Minuten, ohne die Nadel zu entfernen.
Ligat das arterielle Gefäß von einer Seite und das käufliche Gefäß von der anderen Seite. Entfernen Sie dann die Milz, indem Sie direkt über den beiden Ligaturen schneiden. Nähen Sie das Bauchperitoneum und die Haut und desinfizieren Sie den Bereich gut.
Ziel dieses Experiments ist es, die Fähigkeit von CTCs von Darmkrebspatienten zu testen, die Leber durch Induktion einer sichtbaren metastatischen Voraussicht zu besiedeln. Die Isolierung und Etablierung der klinischen Tumorzelllinie ist ein emergentes Werkzeug sowohl für grundlegende als auch für translationale Studien. Zum Beispiel, wenn Sie ein Gen von Interesse haben, bei dem die In-vivo-Studien gezeigt haben, dass dieses Gen an der Migration und Invasionskapazität von Darmkrebszelllinien beteiligt ist, könnte das Ausschalten dieses Gens in zirkulierenden Tumorzelllinien vor der Injektion in die Milz von Mäusen ein gutes Werkzeug sein, um sie die Leber kolonisieren zu lassen, könnte ein gutes Werkzeug sein, um Ihr Ergebnis in vivo zu bestätigen.
Für translationale Studien besteht unsere Hauptperspektive bei der Isolierung zirkulierender Tumorzelllinien darin, dieses wertvolle Material in der personalisierten Medizin zu verwenden. Aus den Blutproben des Patienten würden wir CTCs in Kultur für zwei oder drei Wochen isolieren und amplifizieren, um genügend Material zu haben, um das verfügbare Arzneimittelpanel zu screenen und seine Zytotoxizität zu bewerten, um schließlich zuzuordnen
