Bioinformatik ist eine nützliche Möglichkeit, Informationen aus Datensätzen zu extrahieren. Experimente sind für die Validierung gleichermaßen wichtig. Wir kombinieren beide Ansätze, um die Rolle der Kerbsignalisierung bei Eierstockkrebs zu untersuchen.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher die Informationen aus den Bioinformatik-Datenbanken nutzen können, um ihre Forschungsrichtung vor der Durchführung eines Experiments zu planen. Mit akkumulierten Bioinformatik-Daten menschlicher Krankheiten sind Wissenschaftler nicht mehr mit verbundenen Augen verbunden. Experimente können durchgeführt werden, um spezifische Befunde zu validieren, was zu verbesserten Therapien oder zur Diagnose von Krankheiten führen kann.
Für die Meta-A-Analyse der Assoziation eines Gens von Interesse mit einer bestimmten Krebsart erstellen Sie ein Konto mit einer akademisch verbundenen E-Mail-Adresse, um auf die PRECOG-Datenbank zuzugreifen und die E-Mail-Adresse und das Passwort einzugeben, die mit dem Konto verknüpft sind, in das Login-Terminal. Klicken Sie auf Details anzeigen und geben Sie das betreffende Gen in die Suchleiste ein. Verwenden Sie dann die Scrollleiste, um den Überlebens-Z-Score für die spezifische Krebsart zu erhalten.
Um den Zusammenhang zwischen Genexpressionsniveaus und Eierstockkrebsstadien zu untersuchen, navigieren Sie zur CSIOVDB-Webseite und geben Sie den Namen des interessierenden Gens in die Suchleiste ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Überleben. Um Genexpressionsdaten in verschiedenen, normalen und Tumorgeweben zu bewerten, navigieren Sie zum GENT-Portal, und klicken Sie auf die Registerkarte Suchen.
Wählen Sie im Schlüsselwortabschnitt das Gensymbol für die Begriffe aus dem Dropdown-Menü aus, geben Sie das Gensymbol des betreffenden Gens ein, und wählen Sie Für die Typoption Gewebe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen. Zusammenfassungsdiagramme der Genexpression in Normal- und Tumorgeweben verschiedener Krebsarten, basierend auf den Plattformen U133A und U122 Plus 2, werden angezeigt.
Klicken Sie dann auf den Link Ergebnisdatendownload, um auf die detaillierten Informationen zu den Genexpressionswerten, Gewebetypen und Datenquellen zuzugreifen. Um nach genetischen Veränderungen und Signalnetzwerken zu suchen, öffnen Sie die Webseite des CBIO-Portals, und klicken Sie auf die Zielseite, klicken Sie unter Abschnitt Studien auswählen auf die von Interesse interessierten Organe oder Gewebe, wählen Sie die jeweilige Studie aus, und klicken Sie auf Abfrage nach Gene. Wählen Sie im Abschnitt Genomprofile auswählen die Mutationen, die Änderungen der vermeintlichen Kopiernummer aus GISTIC oder die MRNA-Expressionsoption aus.
Wählen Sie die entsprechenden Daten aus dem Menü Patienten/Fallsatz auswählen aus, und geben Sie die Zielgensymbole in das Abfragefeld von Enter Genes ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abfrage senden, und öffnen Sie die Registerkarte Netzwerk, um das gewünschte Gennetzwerk abzurufen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Datei, und wählen Sie Als Bild PNG speichern zum Herunterladen von Netzwerkbildern aus.
Um Fliegen mit NICD oder NICD und Mam-Überexpression zu erstellen, bereiten Sie die entsprechenden Fliegenbestände vor und wenden sie die zeitliche und regionale Genexpressions-Targeting-Technik an, um die raumzeitliche Genexpression gemäß Standardprotokollen zu steuern. Heben Sie die Fliegen bei 18 Grad Celsius bis zum Erwachsenenalter, bevor Sie 48 Stunden lang auf 29 Grad Celsius mit Hefe umschalten. Am Ende der 29 Grad Celsius Inkubation drei Milliliter PBS zu einer Embryo-Sammelschale hinzufügen und die Fliegenkultur mit einem Kohlendioxidpad anästhesieren.
Verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops, um eine anästhesierte weibliche Fliege zu identifizieren, und verwenden Sie ein Paar sezierende Zangen, um vorsichtig den unteren Thorax der Fliege zu greifen. Tauchen Sie die Fliege in der PBS innerhalb der Embryo-Entnahmeschale, und verwenden Sie ein zweites Paar Zange, um den Unterbauch zu kneifen, ziehen sanft, um die inneren Organe zu lösen. Suchen und lösen Sie das Paar eierstöcke vom Fliegenkörper, und brechen Sie die Muskelhülle, die sich am hinteren Ende der Eierstöcke befindet, um die Ovarials zu trennen.
Dann legen Sie die isolierten Eierstöcke in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, das 500 Mikroliter PBS enthält, auf Eis. Wenn alle Eierstöcke gesammelt wurden, ersetzen Sie die PBS durch 500 Mikroliter 4%Formaldehyd, und legen Sie das Rohr für 10 Minuten auf einen Nutator. Am Ende der Inkubation die Fixierung entsorgen und die Eierstöcke mit drei, 15-minütigen Spülungen in einem Milliliter PBT pro Wäsche waschen.
Nach der letzten Wäsche die Eierstöcke 10-15 Minuten lang mit 150 Mikrolitern zu je 10 Mikroliter dAPI auf dem Nutator beschriften. Am Ende der Inkubation die Eierstöcke einmal 10 Minuten mit einem Milliliter PBT waschen, gefolgt von zwei 10-minütigen Wäbungen in PBS. Nach der zweiten Wäsche alle bis auf die letzten 300 Mikroliter PBS entfernen und eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um die Eierstöcke mehrmals zu triteratieren, um die Eierkammern zu befreien.
Als nächstes sedimentieren Sie das Eierstockgewebe vorsichtig durch eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie so viel PBS wie möglich, ohne das Eierstockpellet zu stören. Mit einer 1.000 Mikroliter-Pipettenspitze etwa drei Tropfen Montagelösung auf das Rohr übertragen und eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit ca. 0,33 Millimetern vom Ende gestutzt verwenden, um die gesamten 120 Mikroliter eiervaryhaltigen Montagelösung auf ein Glasmikroskopschlitten zu übertragen. Legen Sie ein Abdeckglas vorsichtig über die Montagelösung und versiegeln Sie die Kanten mit transparentem Nagellack.
Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung mit einer 0,8 Blende, um Bilder der gebeizten und montierten Eierstöcke zu erfassen. Mit dem PRECOG-Portal können die Z-Scores von NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 bei Eierstockkrebs ermittelt werden. Die negativen Z-Score-Werte deuten auf das schlechte Gesamtüberleben von Patienten mit hohem Expressionsniveau der drei Gene hin.
Die Verwendung der CSIOVD-Datenbank zur Bestätigung dieser Befunde zeigt weiter, dass eine hohe Expression von NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 mit einem schlechten Gesamt- und krankheitsfreien Überleben korreliert. Weitere Permutationstests deuten darauf hin, dass NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 stark in Tumorgeweben exprimiert werden. Basierend auf diesen drei Kerngenen kann ein Signalnetzwerk erstellt werden, um die 50 am häufigsten veränderten Nachbargene bereitzustellen, die sich ebenfalls im selben Pfad mit den höchsten Mutationsraten befinden.
Von Interesse ist, dass die Überexpression des Drosophila-Äquivalenten NOTCH-Gens, NICD, allein, keine Tumore bei Drosophila induziert. Während die Überexpression von NICD und Mam zusammen Tumore in Fruchtfliegen induziert, wie das Vorhandensein mehrerer Epithelschichten und angesammelter Zellen zeigt. Weitere Experimente validierung kann den Weg für die Identifizierung von potenziellen neuen drogentherapeutischen Zielen, Krankheitbiomarkern und personalisierten Behandlungen ebnen.
