Die Autoren danken Vanessa Meldener-Harrell für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Die Verwendung von Mäusen als Blutquelle für die Sandfliegenfütterung erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH). Das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des NIAID, NIH (Protokollnummer LPD 68E) genehmigt. Wirbellose fallen nicht unter die NIH-Richtlinien.
1. Nadelpräparation (Abbildung 1)
<ol><li>Ziehen Sie Nadeln und Abschrägung, wie in Meuti und Harrell19beschrieben. Kurz, ziehen Sie Nadeln auf einem zweistufigen Glas Mikropipette Puller, mit Borosilikat Glas Kapillaren.</li>
	<li>Schärfen Sie die Nadeln durch nasses Abschrägen auf dem Micropipette-Abschräger mit einem extra feinen Stein.</li>
</ol>2. Embryo-Sammlung und Mikromanipulation (Abbildung 2)
<ol><li>Fünf Tage vor dem Tag der Injektion, Blut-Feed-Sand fliegen Weibchen wie routinemäßig für die Pflege der Kolonie durchgeführt. Einzelheiten zu Sandfliegenkolonien und benötigtem Material finden Sie unter Lawyer et al.1 Pflegen Sie die Insekten in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C während ihrer gesamten Entwicklung.<ol>
<li>Eines Tages nach der Blutfütterung, fangen blutgefütterte Weibchen von Gruppen von 100-150 in Gipstöpfen mit einem Seitenport. Pflegen Sie die Weibchen, indem Sie sie mit Zuckerlösung (30% Saccharose – genug Volumen, um eine kleine Baumwollkugel zu tränken) füttern, was für die Pflege der Kolonie üblich ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>An Tag 2-3 nach der Blutfütterung, befeuchten Sie NICHT die Gipstöpfe. Die Weibchen auf einem trockenen Substrat zu halten, verhindert eine vorzeitige Eiablage, da Weibchen es vorziehen, Eier auf eine feuchte Umgebung zu legen.</li>
	<li>Führen Sie am 5. Tag nach der Blutfütterung die Embryoentnahme, Mikromanipulation und Mikroinjektion durch. Führen Sie ein feuchtes Filterpapier in die Eiablagekammer ein. Frisch verlegte Embryonen haben keine voll entwickelte Choreographie und wirken weiß. Verwenden Sie während des Verfahrens schwarzes Filterpapier, um die Visualisierung der weißen Embryonen zu erleichtern.</li>
	<li>Übertragen Sie eine kleine Gruppe von Weibchen aus dem Gipstopf in die Ei-Laying-Kammer durch die Seitenöffnungen mit einem Mundsauger. Das Vorhandensein eines feuchten Substrats (das Filterpapier) induziert Weibchen zu Oviposit.</li>
	<li>Nach 30-60 min das Filterpapier mit neu verlegten Embryonen vorsichtig aus der Kammer holen. Das Filterpapier und die Embryonen bis zu 3 Stunden in einer Petrischale aufbewahren. Bewerten Sie während dieser Zeit regelmäßig den Feuchtigkeitsgehalt des Filterpapiers, um sicherzustellen, dass es feucht bleibt. Wiederholen Sie während dieser Zeit die Schritte 2.4 bis 2.6 mit neuen Gruppen von Weibchen und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich.</li>
	<li>Mikroskopdias für die Injektion vorbereiten: Die Eier nacheinander mit einem sehr feinen Pinsel nacheinander sammeln und vorsichtig auf ein anderes Stück feuchtes schwarzes Filterpapier übertragen, das auf einem Mikroskopschlitten mit einem Glasdeckel platziert ist.<ol>
<li>Fügen Sie Wasser in das Filterpapier, genug, um die Embryonen feucht zu halten, aber nicht dazu führen, dass sie weg von der Abdeckung rutschen oder unter dem Deckschein gesaugt werden. Richten Sie die Embryonen gegen den Deckzettel aus. Der Deckelschlupf dient als Backstop, der verhindert, dass die Eier während der Injektion wegrollen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embryo-Injektionen (Abbildung 3)
<ol><li>Beginnen Sie die Injektionen 2,5 bis 3 Stunden nach Beginn der Eiabfuhr. Führen Sie Injektionen bei Raumtemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit im Labor durch.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen genügend Wasser haben, damit sie feucht gehalten werden. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Embryonen während der Injektionen feucht gehalten werden. Wenn sie während des Injektionsprozesses nicht feucht sind, werden Injektionen schwierig, weil die Nadel Probleme hat, den Embryo zu durchbohren. Die richtige Wassermenge ist der Punkt, an dem die Embryonen einen Meniskus wasserumlaufen, aber der Deckelrutsch schwebt nicht auf dem Wasser, wodurch die Embryonen unter den Deckelrutschen schieben. Es ist wichtig, die Wassermenge um die Embryonen während der Injektionen zu überwachen. Fügen Sie Wasser nach Bedarf hinzu, um die Embryonen feucht zu halten.</li>
	<li>Fügen Sie Wasser sorgfältig hinzu, indem Sie eine Bürste mit Wasser benetzen und das Wasser an das hintere Ende des Filterpapiers übertragen. Das Hinzufügen von Wasser auf diese Weise ermöglicht es, Wasser in einer langsamen und kontrollierten Weise hinzugefügt werden, so dass gerade genug hinzugefügt wird, um die Embryonen feucht zu halten. Zu viel Wasser kann dazu führen, dass die Embryonen aus der Ausrichtung schweben, was es schwierig macht, die Embryonen zu injizieren.</li>
	<li>Rücklastinjektion in die Mikroinjektionsnadel mischen. Fügen Sie mit einem handgezeichneten Borosilikatnadelfüller ca. 0,5 bis 1 l Injektionsmischung in die Nadel ein, Gel-Ladepipettenspitzen können ebenfalls verwendet werden. Der Injektionsmix besteht aus einer oder mehreren Führungs-RNA (jeweils 80 ng/l), die auf einen bestimmten Ort abzielt, der mit kommerziellem rekombinantem Cas9-Protein (300 ng/l) gemischt wird.</li>
	<li>Beginnend mit dem Injektionsdruck bei 30 psi, drücken Sie den Injektionsauslöser, um Luft aus der Spitze der Nadel zu vertreiben. Dadurch wird die Injektionsmischung an die Spitze der Nadel zwingen, so dass die Injektionsmischung fließen kann. An diesem Punkt, langsam erhöhen Sie den Halte-/Konstantdruck, bis das Injektionsmaterial zu fließen beginnt, und dann wieder vom Halte-/Konstantdruck, so dass er sich knapp unter dem Punkt der Injektionsmischung befindet, die aus der Nadel fließt. Die gated Einstellung sollte gerade genug Injektionsmaterial liefern, so dass eine kleine Menge an Material gesehen werden kann, um in den Embryo zu gelangen. HINWEIS: Die Injektion von Sandfliegenembryonen unter Halocarbonöl ähnlich wie andere Protokolle, die für Drosophila und Mücken verwendet wurden, wurde ursprünglich getestet, aber der Überlebensprozentsatz für diese Injektionen war sehr gering. Das Überleben wurde durch die Umstellung auf Injektionen auf feuchtem Filterpapier wie oben beschrieben verbessert.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel in die Seite des Embryos ein. Verwenden Sie den Deckelhinterrutsch hinter dem Embryo als Backstop, der der Nadel hilft, den Embryo zu durchbohren. Geben Sie eine kleine Menge Injektionsmischung in den Embryo, bevor Sie die Nadel vorsichtig entfernen.</li>
	<li>Drücken Sie unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel den Injektor, um das aufgefüllte Material von der Nadelspitze zu entfernen. Dies wird helfen, zu verhindern, dass die Nadel verstopft.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Embryo fort. Zwischen jeder Injektion stellen Sie sicher, dass das Filterpapier feucht ist und die Nadel nicht verstopft ist.</li>
	<li>Sobald alle Embryonen injiziert wurden, zählen Sie die Anzahl der injizierten Embryonen, um eine laufende Zählung zu halten.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckelschlupf, indem Sie dem Filterpapier Wasser hinzufügen, damit der Coverslip schwimmt. Verwenden Sie an dieser Stelle eine Sonde (Holzapplikator-Stick mit Anstecknadel an der Spitze) um das Filterpapier an Ort und Stelle zu halten, während ein Finger verwendet wird, um den Deckelrutsch von den injizierten Embryonen wegzuziehen.</li>
	<li>Überschüssiges Wasser aus dem Filterpapier wegblasen, sobald der Deckelschlupf entfernt wurde.</li>
</ol>4. Post-Injection-Aufzucht (G0) (Abbildung 4)
<ol><li>Übertragen Sie das Filterpapier mit den Embryonen auf mehrere Schichten feuchten Filterpapiers, das in eine Petrischale gelegt wird, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Bewahren Sie die Embryonen hier während der Zeit auf, die für die Injektion anderer Embryonen benötigt wird. Embryonen können maximal 3 Stunden lang gehalten werden. Nach der Injektion werden sie langsam braun.</li>
	<li>Sobald alle Embryonen injiziert wurden, übertragen Sie sie manuell auf zuvor befeuchtete kleine Gipstöpfe. Legen Sie nicht zu viele Embryonen in jeden Topf und halten Sie Denabstand zwischen ihnen, um eine mögliche Pilzkontamination zwischen Individuen zu vermeiden. Bedecken Sie die Töpfe mit einem Bildschirm und lagern Sie sie, wie es typischerweise für Sandfliegenkolonie-Eier, die in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C gehalten werden, während ihrer gesamten Entwicklung durchgeführt würde.</li>
	<li>Entfernen Sie am ersten Tag nach der Injektion alle beschädigten und toten Embryonen mit einem Pinsel. Fügen Sie 100 l 0,5% Propionsäure, Tropfen für Tropfen, auf die Gipstöpfe mit den injizierten Embryonen, um die Pilzkontamination zu begrenzen. Die Freisetzung von Zytoplasma von Embryonen, die während des Injektionsprozesses geschädigt wurden, ist besonders günstig für das Pilzwachstum.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Gipstöpfe jeden Tag und entfernen Sie alle schlechten oder toten Embryonen. Wenn Pilz vorhanden ist, entfernen Sie alle infizierten Embryonen und fügen Sie ein paar Tropfen von 0,5% Propionsäure hinzu.</li>
	<li>Larven schlüpfen zwischen Tag 8 und 12 nach der Injektion. Zweimal täglich die neu entstandenen Larven auf neue Gipstöpfe übertragen, in Gruppen von maximal 5-10. Fügen Sie eine kleine Menge Ankost hinzu und überprüfen Sie das Essen 2-3 mal pro Woche.<ol>
<li>Überwachen Sie sorgfältig die Menge an Larvenfutter, da zu viel das Risiko einer Pilzkontamination erhöht. Sandfliegenlarven überleben besser in Gruppen, aber sie können kannibalistisch sein, wenn es nicht genug Nahrung gibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Larven verpupate, trennen Sie sie nach Geschlecht, um die Weibchen als Jungfrauen zu erhalten. Wenn es viele Überlebende gibt, entsorgen Sie die Männchen und halten Sie nur die Weibchen. HINWEIS: Sowohl Männchen als auch Weibchen können Mutationen tragen und übertragen. Da Weibchen jedoch Jungfrauen gehalten werden müssen, bevor sie gekreuzt werden sollen, ist es einfacher, nur die G0 injizierten Weibchen zu verwenden, um zu vermeiden, dass wt Insekten durch Geschlecht getrennt werden müssen. Die G0 Männchen können als Backup gehalten werden, wenn die Anzahl der erwachsenen Überlebenden gering ist und in diesem Fall mit sortierten wt jungfrauen Weibchen gepaart werden.</li>
</ol>5. Auswahl und Screening von mutierten Allelen (Abbildung 5)
<ol><li>Massenüberquerung der G0 Weibchen mit Wt-Männchen in einem Käfig. Blutfüttern Sie sie ganz, wie es für die normale Pflege der Kolonie nen würde.</li>
	<li>Eines Tages nach der Blutfütterung jedes G0 Weibchen mit 2-3 Gew.-Männchen mit einem Mundsauger in einzelne Gipsröhren übertragen. Füttern Sie die Fliegen mit Zucker auf einer kleinen Baumwollkugel, die jeden Tag gewechselt wird, und verwenden Sie eine Spritze Wasser, um sicherzustellen, dass die Putzfeuchtigkeit für die Eiablage geeignet ist.</li>
	<li>Nachdem die G0-Weibchen Eier gelegt haben (entsprechend G1), sammeln ihre Körper einzeln, beschreibte Eppendorfer Röhren zur späteren Genotypisierung. Pflegen Sie die Embryonen, wie sie normalerweise für Wt-Kolonien durchgeführt werden.</li>
	<li>Extrahieren Sie die DNA aus den G0 Weibchen nach der Methode der Wahl.</li>
	<li>Überprüfen Sie die DNA auf das Vorhandensein von Mutationen, z. B. durch die Entwicklung eines PCR-Assays mit Primern, die die Region der erwarteten CRISPR-Schnitte umgeben.</li>
	<li>Bewahren Sie nur die G1-Embryonen auf, die von G0-Weibchen gelegt wurden und Anzeichen einer Transformation zeigen. Wenn sich diese G1-Embryonen zu Pupas entwickeln, trennen Sie sie nach Geschlecht und halten nur die Weibchen. Kreuzen Sie die G1 Weibchen von der gleichen G0 Weibchen zu Wt Männchen, Blut füttern sie, dann in kleinen Gruppen von 2-3 Weibchen und 4-5 Männchen in kleine Behälter übertragen. HINWEIS: Alle G1 Individuen haben eine Chance, eine einzigartige Mutation zu tragen, also wenn die Anzahl der überlebenden Individuen nicht zu hoch ist, dann ist es besser, G1 Weibchen einzeln mit Wt-Männchen zu kreuzen. Der Fall mehrerer Weibchen, die eine andere Mutation in einem selben Röhrchen tragen, ist selten, kann aber auftreten. Wenn ein solcher Fall nach der Genotypisierung beobachtet wird, sollten dieG2-Nachkommenweibchen dann einzeln mit Wt-Männchen gepaart werden. Dieses Paarungsschema vermeidet die Möglichkeit mehrerer Mutationen in der Nachkommenschaft.</li>
	<li>Nach der Eiablage die weiblichenG1-Körper sammeln und auf Mutationen abschirmen. Bewahren Sie nur die Röhren auf, in denen mindestens ein Weibchen Anzeichen einer Mutation zeigte.</li>
	<li>Für spätere Generationen machen einzelne Paar in-Kreuze. Nach der Eiablage, Bildschirm Eltern für das Vorhandensein von Mutation. Wiederholen Sie dies bei jeder Generation, bis beide Elternteile für die gleiche Mutation homozygot sind. Einmal identifiziert, werden sie die Gründer eines homozygoten mutierten Bestandes sein.</li>
</ol>

<ol>
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Wir präsentieren hier eine kürzlich entwickelte Embryo-Mikroinjektionsmethode für gezielte Mutagenese von CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi Sandfliegen. Embryo-Mikroinjektion zur insektengenetischen Veränderung wurde Mitte der 1980er Jahre21 in Drosophila entwickelt und wird heute routinemäßig in einer Vielzahl von Insekten eingesetzt. Andere Methoden zur Lieferung von genetischen Veränderungsmaterialien wurden für den Einsatz in Insekten entwickelt, wie ReMOT<sup class...

Vektorübertragene Krankheiten stellen in ständiger Weiterentwicklung eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Hunderte von Vektorarten, die sich über sehr unterschiedliche phylogene Familien (z. B. Mücken, Zecken, Flöhe) verteilen, sind für die Übertragung einer großen Anzahl von mikrobiellen Krankheitserregern verantwortlich, was nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation zu mehr als 700.000 Todesfällen pro Mensch pro Jahr führt. Unter den Vektorinsekten bilden Phlebotomin-Sandfliegen (Diptera, Psychodidae) eine große Gruppe, mit 80 bewährten Vektorarten, die unterschiedliche phänotypische Merkmale und vektorielle Fähigkeiten aufweisen, die in verschiedenen geographischen Regionen zu finden sind. Sie sind Vektoren für die protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania, verursacht etwa 1,3 Millionen neue Fälle von Leishmaniosen und zwischen 20.000 und 30.000 Todesfälle pro Jahr. Leishmaniose klinische Ergebnisse sind vielfältig, mit Symptomen, die von selbstbegrenzenden hautenden Läsionen bis hin zu viszeraler Verbreitung reichen, die in Ermangelung einer Behandlung tödlich ist.
Sandfliegen sind streng terrestrische Insekten. Ihr Lebenszyklus, relativ lang im Vergleich zu anderen Diptera, dauert bis zu drei Monate, abhängig von verschiedenen Parametern wie Temperatur, Feuchtigkeit, und Ernährung. Es besteht aus einem embryonalen Stadium (6 bis 11 Tage), vier Larvenstadien (insgesamt 23 bis 25 Tage) und einem Pupalstadium (9 bis 10 Tage) gefolgt von Metamorphose und dann Erwachsenwerden. Sandfliegen benötigen eine feuchte und warme Umgebung für die Aufzucht. Sowohl Männchen als auch Weibchen ernähren sich von Zucker, der in freier Wildbahn aus Blütennektaren gewonnen wird. Nur Weibchen sind Blutfütterer, da sie Proteine benötigen, die aus der Blutmahlzeit für die Eiproduktion gewonnen werden1.
Ein wichtiger Forschungsschwerpunkt ist die Identifizierung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen, die zur Entwicklung übertragbarer Infektionen führen. Wie bei anderen Vektorinsekten haben Parameter, die Sandfliegen innewohnen, gezeigt, dass sie ihre Vektorkompetenz beeinflussen, was als ihre Fähigkeit definiert ist, Krankheitserreger zu tragen und auf ihre Wirte zu übertragen. Zum Beispiel kann die Expression von Galektinen durch die Phlebotomus papatasi Sandfliegen-Mitteldarmzellen, die als Rezeptoren fungieren, die Parasitenoberflächenkomponenten erkennen, ihre Vektorkompetenz für Leishmania major2,3direkt beeinflussen. Der Immunantwortweg von Insekten, Immundeficiency (IMD), ist auch entscheidend für die Phlebotomus papatasi Sandfliegenvektor-Kompetenz für Leishmania major4. Eine entscheidende Rolle für Vektorinsekten Immunantwort Bahnen bei der Kontrolle ihrer Übertragung von infektiösen Krankheitserregern wurde ähnlich berichtet in Aedes aegypti Mücken5,6,7, in der Tsetse Fly Glossina morsitans8, und in Anopheles gambiae Mücken9,10.
Studien über Sandfliegen/Leishmanie-Wechselwirkungen wurden durch den Mangel an Methoden zur Modifikation der Genexpression, die für den Einsatz in diesen Insekten angepasst wurden, eingeschränkt. Bis vor kurzem wurdennur 11,12,13,14 durch kleine interferierende RNA (siRNA) durchgeführt. Die Technik, begrenzt durch die Mortalität im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von erwachsenen Frauen, führt nur zu einem teilweisen Verlust der Funktion, die nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann.
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die funktionelle Genomforschung bei Nicht-Modellorganismen wie Sandfliegen revolutioniert. Modifiziert vom adaptiven Immunsystem in Prokaryoten zur Abwehr von Bakteriophagen15,16, wurde das CRISPR Cas9-System schnell als Genom-Editing-Tool für überlegene eukaryotische Organismen, einschließlich Insekten, angepasst. Das Prinzip der gezielten Genombearbeitung von CRISPR/Cas9 basiert auf der Komplementarität einer einzelnen Führungs-RNA (sgRNA) zu einem bestimmten genomischen Ort. Die Cas9-Nuklease bindet an die sgRNA und erzeugt einen Doppelstrang-DNA-Bruch (dsDNA) in der genomischen DNA, bei dem die sgRNA mit ihrer komplementären Sequenz assoziiert. Der Cas9-sgRNA-Komplex wird durch 17 bis 20 komplementäre Basen in der sgRNA zum gewählten Ort zur Zielsequenz geführt, der dsDNA-Bruch kann dann durch zwei unabhängige Wege repariert werden: nichthomologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)17. Die NHEJ-Reparatur beinhaltet einen einfachen Abschluss der Unterbrechung, führt aber häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. DNA-Reparatur durch HDR verwendet ein Spender-DNA-Molekül, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Insekten besitzen beide Maschinen.
Die CRISPR/Cas9-Technologie kann Mutationen in einem ausgewählten Ort über den NHEJ-Reparaturweg erzeugen; oder für komplexere Genom-Editing-Strategien, wie Knock-Ins oder Ausdrucksreporter, durch den HDR-Pfad mit einer geeigneten Spendervorlage. Bei Sandfliegen wurden null mutierte Allele des Immunantwortfaktors Relish durch NHEJ-vermittelte CRISPR in Phlebotomus papatasi4erzeugt. Sandfliegen-Embryonen wurden auch in einer anderen Studie mit einem CRISPR/Cas9-Mix injiziert, der auf das Gen abzielt, das Yellow kodiert. Dennoch wurden keine Erwachsenen mit der Mutationproduziert 18. Wir beschreiben hier eine detaillierte Methode der Sandfliegengezielten Mutagenese durch NHEJ-vermittelte CRISPR/Cas9, mit einem besonderen Fokus auf die Embryo-Mikroinjektion, ein kritischer Schritt des Protokolls.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Sandfliegen sind die natürlichen Vektoren für Leishmanien-Arten, Protozoen-Parasiten, die ein breites Spektrum von Symptomen produzieren, die von Hautläsionen bis hin zu viszeraler Pathologie reichen. Die Entschlüsselung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen ist von primärer Bedeutung für ein besseres Verständnis der Leishmanie-Übertragung auf ihre Wirte. Unter den Parametern, die die Sandfliegenvektorkompetenz steuern (d.h. ihre Fähigkeit, Krankheitserreger zu transportieren und zu übertragen), spielten parameter, die diesen Insekten innewohnen, eine Schlüsselrolle. Die Insektenimmunantwort zum Beispiel beeinflusst die Sandfliegenvektorkompetenz auf Leishmania. Die Untersuchung solcher Parameter wurde durch das Fehlen von Methoden zur Veränderung der Genexpression eingeschränkt, die für die Verwendung in diesen Nichtmodellorganismen angepasst wurden. Eine Gendownregulation durch kleine störende RNA (siRNA) ist möglich, aber neben der technischen Herausforderung führt das Silencing nur zu einem partiellen Funktionsverlust, der nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann. Die gezielte Mutagenese durch CRISPR/Cas9-Technologie wurde kürzlich an die Phlebotomus papatasi Sandfliege angepasst. Diese Technik führt zur Erzeugung übertragbarer Mutationen in einem speziell ausgewählten Ort, der es ermöglicht, die genesweisend zu untersuchen. Das CRISPR/Cas9-System basiert auf der Induktion gezielter Doppelstrang-DNA-Breaks, die später entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder durch Homology Driven Repair (HDR) repariert werden. NHEJ besteht aus einem einfachen Abschluss der Pause und führt häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. Im Gegensatz dazu verwendet HDR das Vorhandensein eines Spender-DNA-Moleküls, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Hier präsentieren wir eine Sandfliegen-Embryo-Mikroinjektionsmethode zur gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 mit NHEJ, der bisher einzigen Genommodifikationstechnik, die an Sandfliegenvektoren angepasst ist.

Das hier beschriebene CRISPR/Cas9-Mikroinjektionsprotokoll zur Erzeugung von Sandfliegenmutanten wurde in einer früheren Publikation4eingerichtet. Dieser Ansatz führte zu einer hocheffizienten Mutagenese, da 11 von 540 Personen das Verfahren überlebten, von denen 9 mutiert waren. Beim Entwerfen von Leitfäden für die CRISPR/Cas9-Mutation besteht ein wichtiger erster Schritt darin, die Region um das zielgerichtete Gebiet zu sequenzieren. Die Vorlage für die Sequenzierung sollte von dem Stamm s...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K Aufrufe.  National Institutes of Health. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Serie: Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Forschung

Genetik

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...