Name: embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
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Diese Arbeit wurde teilweise durch UCSD-Startup-Fonds unterstützt, die an O.S.A. gerichtet waren.

1. C. quinquefasciatus Kolonieaufzucht
<ol><li>Richten Sie mehrere Kolonien von C. quinquefasciatus-Erwachsenen in Käfigen von Insektenschlafsälen ein. HINWEIS: Die Kolonien wurden von Dr. Laura Harrington an der Cornell University20zur Verfügung gestellt. Detaillierte Protokolle für die Aufzucht von Culex-Moskitos finden Sie in anderer Literatur21.<ol>
<li>Halten Sie die Moskitos bei 25 ± 1 ° C bei 30% Luftfeuchtigkeit mit einem Tag:Nacht-Zyklus von 12:12 h.</li>
		<li>20% ige Zuckerlösung ad libitum bereitstellen, indem Sie einen Zuckerlösungsbehälter mit einem Docht in den Käfig einführen oder Wattebällchen mit der Zuckerlösung sättigen und in den Käfig legen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie Moskitos sich mindestens 3 Tage vor der Blutfütterung paaren (Abbildung 2A).</li>
</ol>2. Sammlung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium
<ol><li>Nach 3-6 Tagen nach der Eklosion den Weibchen 1-2 ml eines citrierten Rinderblutmehls durch eine synthetische Membran zuführen und in einem Blutfütterungssystem auf ca. 40 °C erhitzt werden (Abbildung 2B). Es gibt auch alternative Blutfütterungsprotokolle, die für Culex-Moskitos verwendet werden können (z. B. siehe Referenz21). HINWEIS: C. quinquefasciatus ist bekannt für eine Vorliebe für Vogelblut. Einige Labore verwenden betäubte lebende Vögel oder Vogelblut für ihre Blutmahlzeitquelle21,22,23. Kolonien können jedoch trainiert / ausgewählt werden, um sich von Rinderblut oder kleinen Nagetieren zu ernähren, wenn dieses Merkmal über mehrere Generationen hinweg ausgewählt wird.<ol>
<li>Lassen Sie die Weibchen mindestens 3 Tage nach der Blutfütterung ruhen, um sich einer Oogenese und Eireifung zu unterziehen, bevor sie die Eiablage für Mikroinjektionsexperimente induzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen Sie am Tag der embryonalen Mikroinjektionen einen Eiablagebecher mit organisch infundiertem Eiablagewasser. Eiablagewasser sollte durch Fermentieren von Kaninchenkot (50 g / L), Zersetzen von Gras (4,5 g / L) oder Fischfutter (25 g / L) in Wasser im Laufe von 5 oder mehr Tagen24,25hergestellt werden.</li>
	<li>Legen Sie den Eiablagebecher in den Käfig und stellen Sie den gesamten Käfig an einen dunklen Ort (Abbildung 2C).</li>
	<li>Überprüfen Sie den Becher alle 30 Minuten auf Eierflöße.<ol>
<li>Wenn Eierflöße vorhanden sind, sammeln Sie die Flöße, indem Sie sie mit einem Pinsel schaufeln und auf ein nasses Filterpapier legen (Abbildung 2D, E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ausrichtung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium
<ol><li>Trennen Sie die Eier von den Flößen, indem Sie auf das Floß drücken und die Eier einzeln mit einem feinen Pinsel und einer Zette auseinander necken (Abbildung 2E).</li>
	<li>Richten Sie einzelne Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, der über die Oberseite eines Glasobjektträgers gelegt wird (Abbildung 2F).</li>
	<li>Versuchen Sie beim Ausrichten, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu richten, um die Zugänglichkeit zu erleichtern. HINWEIS: Eine alternative Methode zur Ausrichtung der Eizellen ohne doppelseitiges Klebeband finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Nasonia vitripennis Embryo-Mikroinjektionsprotokoll26.</li>
	<li>Eier mit der Halogenkohlenstoffölmischung abdecken. HINWEIS: Die Halocarbon-Mischung kann im Voraus hergestellt werden, indem zwei Halogenkohlenstoffreagenzien und Wasser (9:1:20, Halogenkohlenstoff 700: Halogenkohlenstoff 27: Reinstwasser) sanft gemischt und dann über Nacht bei 25οC inkubiert wird, um die Wassersättigung des Halogenkohlenwasserstofföls zu erleichtern.</li>
</ol>4. Nadelvorbereitung für Mikroinjektionen
<ol><li>Erzeugen Sie die Aluminosilikatkapillarglasnadeln mit einem Glasmikropipettenzieher.<ol>
<li>Legen Sie ein Aluminosilikatkapillarglas in einen Nadelzieher, gemäß den Anweisungen aus der Bedienungsanleitung des Nadelziehers. HINWEIS: Quarz- und Borosilikatkapillarnadeln können ebenfalls verwendet werden, aber für dieses Experiment wird Aluminosilikat wegen seiner relativen Erschwinglichkeit und Haltbarkeit bevorzugt.</li>
		<li>Stellen Sie Heat auf 516, Velocity auf 100, Delay auf 70, Pull auf 97 und Pressure auf 500 am Nadelzieher ein.</li>
		<li>Aktivieren Sie den Nadelzieher gemäß den Anweisungen des Abziehers und wiederholen Sie ihn nach Bedarf für zusätzliche Nadeln. HINWEIS: Während des Injektionsprozesses werden Nadeln oft verstopft oder versehentlich gebrochen, daher wird dringend empfohlen, zusätzliche Nadeln für ein einzelnes Experiment zu ziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichten Sie die Nadelspitze, indem Sie die Spitze der gezogenen Nadel auf der rotierenden Diamantschleifplatte vorsichtig berühren, für ca. 10 s in einem Winkel von 50°. HINWEIS: Wenn Sie die Nadel anfassen, wird sie geöffnet, damit Flüssigkeit durchfließen kann, während gleichzeitig eine schärfere Spitze für ein leichteres Eindringen in den Embryo entsteht. Ein Beispiel für eine richtige Nadel kann in einem früheren Artikel26gesehen werden.</li>
	<li>Lagern Sie gezogene und abgeschränkte Nadeln, indem Sie sie in Linien aus Modellierton in einer Petrischale einbetten. HINWEIS: Um die beste Qualität für Nadelspitzen zu gewährleisten, sollten Nadeln so nah wie möglich am Zeitpunkt der Injektion frisch gezogen und abgeschrächt werden.</li>
</ol>5. Einlegen des Injektionsgemisches
<ol><li>Bereiten Sie die Injektionsmischung aus Genommodifikationsreagenzien (z. B. 200 ng / μL sgRNA und 200 ng / μL Cas9-Mischung) oder bevorzugten Injektionslösungen vor und halten Sie sie auf Eis. HINWEIS: Diese Mischung kann zubereitet werden, während auf die Eizellen gewartet wird. Weitere Details zur Cas9- und sgRNA-Produktion und -Vorbereitung für die Mikroinjektion finden Sie in früheren Publikationen27,28,29,30.</li>
	<li>Laden Sie 2 μL Injektionsmischung mit einer Mikroladerspitze in die Injektionsnadel.</li>
</ol>6. Mikroinjektion eingerichtet
<ol><li>Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist.</li>
	<li>Legen Sie den Glasträger mit den ausgerichteten Eiern auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops.</li>
	<li>Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und dem zusammengesetzten Mikroskop so aus, dass sie in einem Winkel von 25-35 ° auf das hintere Ende des Embryos zielt.</li>
</ol>7. Mikroinjektion des Embryos (Abbildung 2G)
<ol><li>Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung mit einer Menge von etwa 10% des Volumens des Embryos (700-800 pL abhängig von der Größe der Eier). HINWEIS: Bei der Injektion sollte das Ei leicht anschwellen, aber wenn zu viel Flüssigkeit injiziert wird, können Eier platzen oder zytoplasmatische Flüssigkeit kann austreten.</li>
	<li>Injizieren Sie etwa 20 Eier gleichzeitig, stoppen Sie dann und führen Sie Embryo-Genesungsverfahren durch. HINWEIS: Während der Injektion besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Nadeln entweder verstopfen oder brechen. Wenn ein Verstopfung auftritt, der durch einen Mangel an Injektionsflüssigkeit, die durch die Nadel fließt, festgestellt werden kann, versuchen Sie entweder, die Nadel mit der Reinigungsfunktion des elektronischen Mikroinjektors zu reinigen oder versuchen Sie, die Nadel neu zu entränken. Wenn keiner der beiden Schritte funktioniert, wechseln Sie schnell zu einer neuen Nadel und stellen Sie sicher, dass die vorbereiteten Eier feucht bleiben.</li>
</ol>8. Embryonenentstehung und Schlüpfen
<ol><li>Lassen Sie die Eier mindestens 5 Minuten ungestört. Entfernen Sie das Halogenkohlenwasserstofföl innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig, indem Sie es leicht mit einem sauberen Pinsel bürsten(Abbildung 2H).</li>
	<li>Heben Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse doppelt destilliertes Wasser (Abbildung 2I). Achten Sie darauf, die Eier auf der Wasseroberfläche zu halten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Eier täglich für 7 Tage auf Schlüpfen (Abbildung 2J).</li>
	<li>Befolgen Sie die normalen Larvenaufzuchtverfahren21.</li>
</ol>9. Screening auf Genomveränderung
<ol><li>Screenen Sie die injizierten Moskitos mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen (Abbildung 2K).<ol>
<li>Verifizierung von Mutationen, die keinen leicht erkennbaren Phänotyp aufweisen, durch PCR-Amplifikation, T7-Endonuklease-I-Assay und Sequenzierung durch Subklonierung der Zielregion31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie zusätzliche Kreuzungen zwischen injizierten Individuen ein, um vererbbare Mutationen innerhalb der Keimbahn zu erkennen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. 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Mit den jüngsten Bemühungen, gentechnisch veränderte Werkzeuge für die Kontrolle von Mückenvektoren zu entwickeln, besteht die Notwendigkeit, Embryo-Mikroinjektionsprotokolle für häufige Mückenkrankheitsvektoren zu entwickeln und zu optimieren. Obwohl Methoden für Aedes- und Anopheles-Moskitos entwickelt wurden, wurde ein speziell für Culex entwickeltes Protokoll minimal erforscht. Im Allgemeinen können die Injektionsprotokolle für Moskito-Embryonen in 3 allgemeine Schritte unterteilt werden: 1) Embryo-Entnahme und -Vorbereitung, 2) Embryo-Injektion und 3) Wiederherstellung nach der Injektion. Um erfolgreich Mutanten zu erzeugen, müssen alle drei Schritte für die Zielspezies optimiert werden. Dieses modifizierte Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen ist spezifisch für das erfolgreiche Genom-Engineering von Culex-Moskitos.
Die Maximierung der Embryonentnahme ist ein häufiger Engpass bei Mikroinjektionsprotokollen für Embryonen. Um die Anzahl der in kurzer Zeit gesammelten Eier zu erhöhen, wurden Moskitos für 2-3 Tage nach der Blutmahlzeit von einem Eiablagesubstrat eingeschränkt. Es ist wichtig zu beachten, dass C. quinquefasciatus dazu neigt, Vogelblutquellen im Gegensatz zu Säugetierquellen oder Membranfütterung mit Säugetierblut zu bevorzugen. Viele Forscher haben jedoch Schwierigkeiten, eine zuverlässige Quelle für lebende Vögel oder Vogelblut für die Blutfütterung zu erhalten, so dass Laborbestände angepasst werden können, um sich von leichter zugänglichen Blutquellen zu ernähren. Es ist auch wichtig, nährstoffreiches Wasser für das Eiablagesubstrat zu verwenden, da es Eiablagehinweise für C. quinquefasciatus und die meisten anderen Culex-Vektoren liefert. Es gibt viele Methoden, um nährstoffreiches Wasser zu erzeugen, das möglicherweise zwischen den Laboren optimiert werden muss, um sicherzustellen, dass eine angemessene Anzahl von Eiern für die Mikroinjektion zur Verfügung steht. Während diese Methode beispielsweise bei Kaninchenkot, der 5 oder mehr Tage lang in entionisiertem Wasser fermentiert wurde, am erfolgreichsten war, haben andere Forscher mehr Erfolg mit Gras- oder Fischfutter als Nährstoffquelle und einige sogar mit destilliertem Wasser21.
Da Culex-Moskitos Gruppen von Eiern in Flößen legen, ist das Sammeln von Eiern ziemlich einfach. Eier können einfach gesammelt werden, indem das gesamte Floß mit einem Pinsel geschöpft wird. Die Trennung der Eier ist komplizierter, aber für eine erfolgreiche Injektion unerlässlich. Eier können vorsichtig vom Floß getrennt werden, indem mit Pinsel oder Sparzette sanfter Abwärtsdruck zwischen den Eiern ausgeübt wird. Mit etwas Übung waren mehrere Benutzer zuverlässig in der Lage, einzelne Eier von Eierflößen zu trennen. Nach dem Trennen jedes Eies werden die Eier in der gleichen Ausrichtung auf doppelseitigem Klebeband ausgerichtet, das die Eier während der Mikroinjektion stabilisiert. Eier werden in das sich verjüngende hintere Ende injiziert und die Zugabe von Halogenkohlenstofföl hält die Eier während der Manipulation feucht.
Um Embryoschäden während der Mikroinjektion zu begrenzen, müssen Injektionsnadeln von angemessener Stärke sein und in einem geeigneten Winkel abgeschrägt sein. Aluminosilikatnadeln, die 10 Sekunden lang in einem Winkel von 50 ° abgeschrächt wurden, hatten die besten Ergebnisse, aber auch Borosilikat- und Quarznadeln können funktionieren, obwohl sie weniger haltbar und teurer sein können. Darüber hinaus erleichtert die richtige Nadelfass einen besseren Fluss der Cas9- und sgRNA-Mischungen und schafft einen schärferen Punkt für ein leichteres Eindringen in den Embryo. In vielen Fällen ist das Abfasen auch eine effiziente Möglichkeit, verstopfte Nadeln schnell zu reparieren, anstatt Zeit und Mühe damit zu verbringen, verstopfte Nadeln zu ersetzen.
Nach der Injektion sollten die Eier mindestens 5 Minuten ungestört bleiben, wobei das Halogenkohlenstofföl unmittelbar danach durch sanftes Abbürsten mit einem sauberen Pinsel entfernt werden sollte. Nach dem Entfernen des Halogenkohlenwasserstofföls können die injizierten Eier zum Schlüpfen in Wasser gelegt werden, was typischerweise innerhalb von 3 Tagen nach der Injektion geschieht. Mit Übung und ausreichender Anzahl von Eiern kann dieses Protokoll konsistente somatische und Keimbahnmutationen bei C. quinquefasciatus erreichen und ist vielseitig genug, dass es leicht an andere Culex-Moskitos angepasst werden kann.

C. quinquefasciatus, allgemein bekannt als die südliche Hausmücke, ist ein kompetenter Vektor zahlreicher Krankheitserreger, darunter West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, Saint Louis-Enzephalitis und Östliche Pferdeenzephalitis. Insbesondere seit seiner ersten Erkennung in New York im Jahr 1999 hat sich WNV zu einer der wichtigsten vektorübertragenen Krankheiten in den kontinentalen Vereinigten Staaten (USA) entwickelt, mit über 50.000 gemeldeten menschlichen Fällen, die zwischen 1999 und 2018 zu rund 2.300 Todesfällenführten 1 sowie über 4.500 gemeldeten Pferdefällen zwischen 2008 und 20192. Darüber hinaus sind mindestens 23 in Nordamerika vorkommende Vogelarten von WNV-Infektionen betroffen, wobei mindestens 12 Arten aufgrund von WNV3als unwiederbringlich eingestuft wurden. Die Auswirkungen von WNV auf Menschliche, Pferde- und Vogelpopulationen sind auf das opportunistische Fressverhalten seiner Vektoren zurückzuführen. Typischerweise sind Vögel die primären Wirte für WNV, und Menschen und Pferde sind zufällige oder Sackgassenwirte. Einige von C. quinquefasciatus vektorisierten Krankheitserreger infizieren nur Vögel wie den Vogelmalariaparasiten Plasmodium relictum. In Hawaii ist C. quinquefasciatus ein Hauptvektor der Vogelmalaria und hat das Aussterben vieler einheimischer Vogelarten verursacht4,5.
Um Krankheiten zu kontrollieren, die von C. quinquefasciatusübertragen werden, haben Forscher und Vektorkontrollbehörden häufig etablierte Instrumente zur Kontrolle der Mückenpopulation wie die Anwendung von Insektiziden6verwendet, diese Methoden sind jedoch kostspielig, nicht artspezifisch und haben eine begrenzte Wirksamkeit, da die Resistenz gegen Insektizide in vielen C. quinquefasciatus-Populationen hoch ist6,7,8,9. Andere Kontrolltechniken, wie Wolbachia-basiertePopulationskontrollstrategien, wurden in den letzten Jahrenentwickelt 10,11, aber die mit wolbachia-Infektion verbundenen Fitnesskosten begrenzen die Machbarkeit dieses Ansatzes für diesen Vektor12. Es gibt auch genetisch basierte Bekämpfungsmethoden, die bei anderen Mückenarten wie Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 und Anopheles stephensi16 entwickelt wurden , einschließlich der Entwicklung von pathogenresistenten Moskitos17,18,19, die auch für C. quinquefasciatus entwickelt werden könnten, wenn die erforderlichen Genom-Engineering-Werkzeuge entwickelt für diese Art. Die Biologie von C. quinquefasciatus unterscheidet sich jedoch stark von anderen Aedes- und Anopheles-Mückenvektoren, was die Entwicklung ähnlicher genetischer Technologien in diesem Vektor erschwert hat. Mit dem Aufkommen von CRISPR-basierten Genom-Engineering-Technologien ist präzises Genome Engineering immer trivialer, erschwinglicher und anpassungsfähiger geworden und hat folglich zur Entwicklung neuartiger genetischer Werkzeuge in einer Vielzahl von Arten geführt.
Um Mutationen mit CRISPR-basierten Technologien zu erzeugen, wird eine Mischung aus Cas9-Protein und synthetischer Leit-RNA (sgRNA), die die gewünschten Loci ergänzt, in Embryonen im Präblastodermstadium mikroinjektiert. Da C. quinquefasciatus Weibchen ihre Eier in Gruppen ablegen, die in einer schwimmenden Floßstruktur befestigt sind (Abbildung 1), im Gegensatz zum Ovipositieren einzelner Eier, einem Merkmal von Aedes und Anopheles Moskitos, werden Embryo-Mikroinjektionen bei dieser Art zunehmend komplizierter. Culex-Larven treten auch von der vorderen Seite jedes Eies auf, die mit der Wasseroberfläche in Kontakt kommt (Abbildung 1), so dass die Eiorientierung nach der Manipulation bei dieser Art wichtig ist. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Cas9-Protein und sgRNA in C. quinquefasciatus-Embryonen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Merkmale zu berücksichtigen, die für die Culex-Biologie einzigartig sind, um das Überleben von Embryonen und die Genommutationsraten durch bestimmte Schritte zu verbessern, die für die rechtzeitige Eizellentnahme und das Überleben von Eizellen entscheidend sind.

<table><tbody><tr><td>9 oz clear plastic pet cup</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>Insect Rearing and Egg Collection</td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Cas9 Protein with NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Olympus BX41</td><td></td><td>Microinjection, for embryo injection</td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>Microinjection, to be used with beveler</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Microinjection, embryo collection</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>Line Maintenance</td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinjection, needle beveling</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td>Microinjection, needle pulling</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Non-Drying Modeling Clay</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinjection, needle storage</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Microinjection, for embryo alignment</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% sugar solution for adult sugar source.</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr></tbody></table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus ist ein Vektor einer Vielzahl von vektorübertragenen Krankheiten wie Vogelmalaria, West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, östliche Pferdeenzephalitis, lymphatische Filariose und Saint Louis-Enzephalitis. Insbesondere vogelmalaria hat eine wichtige Rolle beim Aussterben zahlreicher endemischer Inselvogelarten gespielt, während WNV in den Vereinigten Staaten zu einer wichtigen vektorübertragenen Krankheit geworden ist. Um weitere Einblicke in die Biologie von C. quinquefasciatus zu erhalten und ihre genetische Kontroll-Toolbox zu erweitern, müssen wir effizientere und erschwinglichere Methoden für das Genome Engineering bei dieser Art entwickeln. Einige biologische Merkmale, die für Culex-Moskitos einzigartig sind, insbesondere ihre Eierflöße, haben es jedoch schwierig gemacht, Mikroinjektionsverfahren durchzuführen, die für das Genom-Engineering erforderlich sind. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein optimiertes Mikroinjektionsprotokoll für Embryonen entwickelt, das sich auf die Minderung der technischen Hindernisse konzentriert, die mit den einzigartigen Eigenschaften von Culex-Moskitos verbunden sind. Diese Verfahren zeigen optimierte Methoden für die Eizellentnahme, die Trennung von Eierfloßen und andere Handhabungsverfahren, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion bei C. quinquefasciatus unerlässlich sind. In Verbindung mit der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen uns diese Verfahren, ortsspezifische, effiziente und vererbbare Keimbahnmutationen zu erreichen, die erforderlich sind, um fortschrittliches Genom-Engineering durchzuführen und genetische Kontrolltechnologien in diesem wichtigen, aber derzeit noch nicht untersuchten Krankheitsvektor zu entwickeln.

In zuvor veröffentlichten Experimenten wurde diese Methode verwendet, um erfolgreich somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges, weiß (CPIJ005542)30 (Tabelle 1) kritisch ist. CRISPR/Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen der Puppenstufe von injizierten Personen (G0)bewertet. Somatische Mutationen waren im Allgemeinen als Mosaikphänotypen vorhanden, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen. Zum Beispiel führten somatische Mutationen des weißen Gens zu einer Mischung von Ommatidien mit Phänotypen, denen es an Pigmentierung mangelt, und solchen mit einem Wildtyp-pigmentierten Phänotyp30. Als es jedoch zu einer Keimbahnmutation des weißen Gens kam, erbte die nächste Generation (G1)den vollen weißäugige Phänotyp. Keimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik G0 Individuen und Scoring für vollständig weißäugige Nachkommen bestimmt (G1). Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64% bis 82% der Embryonen sowie zu einer somatischen Mutageneserate von 37% bis 57% und einer Keimbahnmutageneserate von >61% (Tabelle 1). Durch das Multiplexing von sgRNAs, um mehrere Loci im selben Gen anzusprechen, stiegen die mutageneseraten der somatischen und Keimbahnen auf bis zu 86% an (Tabelle 1). Darüber hinaus werden seit vielen Generationen lebensfähige homozygote Bestände der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Abbildung 1: C. quinquefasciatus Eierfloß und Einzeleimorphologie. Dorsale (A), laterale (B) und ventrale (C) Ansichten von C quinquefasciatus Eierflößen. C. quinquefasciatus Weibchen legen ihre Eier mit der bauchigeren vorderen Seite, die die Wasseroberfläche berührt, während die spitzere hintere Seite von der Wasseroberfläche entfernt ist (D). A- anterior; P- posterior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Zeitleiste für die Schaffung von C. quinquefasciatus-Mutanten durch Mikroinjektion. Zeitleiste der Vorbereitung der C. quinquefasciatus-Kolonie und der Embryonentnahme für die Mikroinjektion (A-D). Gesammelte Eier werden dann getrennt (E) in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet und mit Halogenkohlenstofföl (F) bedeckt. Die Eier werden dann injiziert (G) und mindestens 5 Minuten ruhen gelassen, bevor das Halogenkohlenstofföl (H) entfernt wird. Die Eier werden dann zum Schlüpfen in eine reinen Wasserquelle (I)überführt und auf mutierte Phänotypen ( K )untersucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Überleben</td>
			<td colspan="3">Somatischer Mosaikismus (G0)</td>
			<td>Keimbahnmutagenese (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Insgesamt (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Insgesamt (%)</td>
			<td>G1 Mutanten (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Überlebens- und Mutationsraten von Embryonen, die mit einzelnen und multiplexierten gRNAs injiziert wurden, die auf Weiße abzielen. Die Tabelle wird mit Genehmigung von30 nachgedruckt

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.4K Aufrufe.  University of California, San Diego. Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Serie: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologie

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Entwicklungsbiologie

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

phiC31 Integrase-vermittelte Embryotransgenese bei Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Mikroinjektion von Embryonen für die Transgenese in Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Zusammenfassung

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