Diese Arbeit wurde mit der Unterstützung eines Zuschusses durchgeführt 5R21HD080684-02, aus dem National Institute of Child Health and Human Development. Der Autor bedankt sich bei Ken Cho für seine anhaltende Begeisterung und Unterstützung. Der Autor möchte auch Bruce Blumberg für die Verwendung seiner Kamera, Rebekka Charney, für die kritische Lesung der Handschrift, und Sean McNamara und Marcin Wlizla an der nationalen Xenopus -Ressource (RRID:SCR_013731), bestätigen für die wertvollen Gespräche über X. tropicalis Fütterung und Pflege der Tiere-Regimen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Verwendung von der University of California, Irvine genehmigt.
1. Vorbereitungen für PGC-Transplantation
<ol><li>Dissektion Werkzeuge als zuvor beschriebenen23im Voraus vorbereiten. Hinweis: Augenbrauen Haare Messer dienen dazu, Einschnitte mit Hilfe einer Haar Schleife um den Embryo zu stabilisieren, während der Durchführung der Operationen zu machen. Augenbrauehaare Haare Schleifen in Borosilikatglas Pasteur Pipetten, die zuerst in eine Flamme gezogen wurden eingeklebt und sind auf den ausgedünnten Teil gebrochen (siehe Abbildung 1A, Pfeilspitze) erstelle ich eine kürzere, schmalere Spitze (Abbildung 1 b) für größere Geschicklichkeit Wenn Operationen durchführen.</li>
	<li>SgRNAs mit Verfahren beschriebenen24 zu generieren. Hinweis: Kurz, kurze DNA-Templates, die Codierung für SgRNAs entstehen mit überlappenden Deoxyoligonucleotides mit 5' Bakteriophagen T7 Promotoren, die getempert werden und "ausgefüllt" durch eine fehlerfreie, thermostabile DNA-Polymerase. In-vitro- SgRNA Synthesereaktionen sind für mehrere Stunden (je nach dem Kit verwendet) über Nacht inkubiert. Reaktionen sind DNAse behandelt, um die Vorlage zu entfernen. Die SgRNAs sind durch Standardmethoden Phenol/Chloroform Extraktion und Ammonium Acetat/Isopropanol Niederschlag, nach der Kit-Hersteller Anweisungen24gereinigt.</li>
	<li>Kurz vor der Durchführung Mikroinjektionen, bereiten Cas9-SgRNA-komplexe durch erste denaturierenden ~ 250 ng der SgRNA in einem Gesamtvolumen von 3 µL RNAse-freie (Diethylpyrocarbonate-behandelt) H2O bei 60-65 ° C für 5 min, gefolgt von schnellen Kühlung für 5 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die SgRNA für ein paar Sekunden, fügen Sie 1 µL 1 µg/µL Cas9 Eiweiß hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei 37 ° C, Komplexbildung zu fördern. Hinweis: Im Anschluss an diese Inkubation kann das Rohr auf Eis gehalten werden, während der Vorbereitung der Embryonen für die Mikroinjektion.</li>
	<li>X. tropicalis Embryonen durch in-vitro- Befruchtung mit Standardmethoden, wie zuvor beschrieben25zu erhalten. De-Gelee25,26 die Embryonen im 10 min nach Befruchtung. Hinweis: Befruchtung Zeit gilt die Zeit nach die Sperma-Suspension mit den Eiern hinzugefügt wird und die Schüssel überschwemmt mit 1/9thX ist Marcs geändert Klingeltöne (MMR)26. Für X. tropicalis25, im Gegensatz zu laevis, führen Sie die de-Gelier-in 1/9 X MMR mit 3 % Cystein freie Base (nicht das HCl-Salz), pH 7,8-8,0 angepasst folgten mehrere Wäschen in 1/9 X MMR. Transfer der Embryonen nach einer Agarose (1 %)-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sofortüberweisung die Embryonen injiziert werden, um eine 1 % Agarose-beschichtete Schale mit 1 X MMR mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>
Spritzen Sie im 1-Zell-Stadium. Siehe Referenzen26,27 für detaillierte Beschreibungen der Xenopus Mikroinjektion Methoden.
	<ol>
<li>Jeder Embryo an einem einzigen Standort in der Tier-Pole, mit 4 Spritzen nL Cas9-SgRNA-Komplex (Endbetrag = 1 ng von Cas9 und ~ 250 Pg SgRNA; siehe die Diskussion)24. Nach 10-20 min der Injektion Website Heilung, transfer der Embryonen zu einer Agarose-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR und inkubieren Sie bei 25 ° C. Auch erstellen Sie eine Schüssel mit uninjected Geschwister Embryonen, die als Transplantat-Empfänger dienen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie Petri Platten (60 mm), die enthalten eine ~ 5 mm-dicke Schicht von 1 % Agarose in 0,3 gemacht X MMR, wenn Transplantationen in X. tropicalisoder 1 X MMR für laevis.
	<ol>
<li>Erstellen Sie Depressionen ~ 3-4 mm tief durch das Einfügen eines 3-x 4-Well Schimmel (erstellt durch das Schneiden einer 96-Well-PCR-Platte) in der geschmolzenen Agarose, wenn die Platten Gießen (siehe Abbildung 1 und D). Halten Sie die Form einige Millimeter über dem Boden der Petrischale mit einer Schelle befestigt an einem Ring-Ständer, bis die Agarose verhärtet hat.</li>
		<li>Stellen Sie außerdem eine 24-Well-Platte zu Haus einzelnen Embryonen durch die Beschichtung der Brunnen mit einer dünnen Schicht von 1 % Agarose Baujahr 1/9 X MMR. Hinweis: Das Kulturmedium hinzugefügt, um diese Brunnen ist 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transplantation von PGCs
<ol><li>Wenn die Embryonen erreichen nur Nieuwkoop und Faber28 Blastozystenstadium 9 (Abb. 2A), ~4.5-h nach Befruchtung (hpf) für X. tropicalis, entfernen Sie sie aus dem Inkubator 25 ° C und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur für eine zusätzliche equilibrate 0,5 h.</li>
	<li>Die Transplantation bei 5 beginnen hpf (Abb. 2 b), mithilfe einer Pasteurpipette eine PGC-Spender-Embryo (injiziert mit Cas9-SgRNA) übertragen, die 60 mm-Agarose-Schale mit Depressionen (erstellt in Schritt 1,7) in 0,3 X MMR (oder 1 X MMR wenn laevisverwenden). Auch ein uninjected Geschwister Embryo, der Transplantat-Empfänger, um dieses Gericht zu übertragen. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Identität eines jeden dieser Embryonen nicht verwechselt werden.</li>
	<li>Manuell entfernen Sie die Dotterhäutchen Umschläge von jedem Embryo mit Pinzette und drehen Sie beide Embryonen zu, so dass ihre Vegetal Pfosten in Ansicht und für Chirurgie zugänglich sind. Hinweis: Eine Beschreibung der manuellen de-Vitellination von Embryonen wurde zuvor beschriebenen26.</li>
	<li>Mit der scharfen Spitze eine Augenbraue Haare Messer, stellen Sie vier flache Einschnitte in der Form eines Quadrats auf den Vegetal Pfosten des Empfängers Embryos innerhalb der Zone, wo zukünftige Flasche Zellen, die die Blastopore markieren bilden werden. Stellen Sie die Einschnitte durch die Spitze des Messers Augenbrauen Haare in den Embryo, knapp unterhalb der Oberfläche, und stellen nach oben schneiden Bewegungen während der Stabilisierung des Embryos mit der Haar-Schleife einfügen. Hinweis: Abbildung 2 zeigt pflanzliche Ansichten eines Embryos im Halbstunden-Takt von 4,5-7,0 hpf, die Zellengröße zu zeigen und bieten eine Anleitung für die Schätzung, wo die Flaschen-Zellen (gestrichelte weiße Kreis) bilden werden. Das Ziel ist es, Einschnitte zu machen, wo die gestrichelte Black-Box angezeigt.</li>
	<li>Sobald die vier Seiten des Platzes durch Ritzlinien abgegrenzt sind, vertiefen Sie jeder Schnitt mit dem Augenbrauen Haare Messer mit ähnlichen schneiden Bewegungen um zu eine Tiefe von ca. 1/3 bis 1/2 der Abstand zum Blastocöl Boden zu erreichen.</li>
	<li>Frei von pflanzlichen Gewebe Explant vom Empfänger Embryo (Abbildung 3A und B) indem man eine horizontale (parallel zur pflanzlichen Oberfläche) Cut(s) in der Tiefe pflanzlichen Region. Hinweis: Die Größe der PGC-haltigen pflanzlichen Explant ist ca. 0,4-0,45 mm pro Seite und 0,25-0,3 mm in die Tiefe. Diese pflanzlichen Explant vom Empfänger Embryo wird nicht mehr benötigt und daher aufzuheben verworfen werden.</li>
	<li>Arbeiten schnell, wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.4-2.6) auf der PGC Spender Embryo um ein Fragment der ähnlich großen pflanzlichen Gewebe für Transplantationen zu erstellen. Hinweis: Es ist wichtig für die Durchführung dieser zweiten Dissektion mit etwas Verspätung zur Minimierung der Zeit für den Empfänger Embryo um seine Wunde zu heilen.</li>
	<li>Sobald das Gewebe mit PGCs vom Spender Embryo entfernt wird, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer und Haar Schleife dieser modellabhängigen in Position in die im Empfänger Embryo entstandene Öffnung bewegen. Hinweis: Die innere Oberfläche des Transplantats Spender muss das Innere des Empfängers Embryos zeigen. Es ist nicht notwendig, entsprechend die Leitlinien der dorsal-Ventral und rechts-links-Achse des Transplantats mit dem Empfänger Embryo.</li>
	<li>Das Transplantat in die Öffnung in der pflanzlichen Oberfläche des Empfängers Embryos sanft drücken Sie mit der langen Kante des Schachtes der Augenbraue Haare Messer, statt parallel zur Oberfläche des Transplantats.</li>
	<li>Sobald das Transplantat gelegt wurde, verwenden Sie eine Hairloop oder die Welle eine Augenbraue Haare Messer um zu schieben "Rohbau" des Embryos Spender über die Agarose-Oberfläche und in einer Agarose-Depression. Stellen Sie sicher, dass die offene Wunde der Karkasse die Masse Flüssigkeit gegenübersteht. Wenn dies nicht der Fall ist, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer um zu drehen, den Embryo um diese Ausrichtung zu erreichen.</li>
	<li>Schieben Sie den Empfänger Embryo mit der Transplantation Heilung im Ort, in einem angrenzenden Depression und ebenso darauf achten Sie, dass das veredelte Vegetal Pole Gewebe die Masse Flüssigkeit gegenübersteht.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.1-2.11) über ein weiteres paar von Spender und Empfänger Embryonen erstelle ich eine weitere Transplantation/Karkasse paar; übertragen Sie diese zu leeren Depressionen. Hinweis: Es ist wichtig, dass man Notationen zu behalten paarweise von Schlachtkörpern und Transplantation tragenden Embryonen macht. Die Spender-Kadaver werden als Proxy verwendet werden, für die Effizienz der Cas9-SgRNA-induzierte Mutagenese in den transplantierten PGCs, die leicht untersucht werden kann nicht, bis die Transplantation tragenden Tiere die Geschlechtsreife erreichen (s.u. Schritt 3.3, und die Diskussion ).</li>
	<li>Weiter Transplantationen zu machen, bis die Embryonen etwa frühen Gastrula-Stadium 10, erreichen die etwa 6,5 hpf in X. tropicalis (siehe Abbildung 2E).</li>
</ol>3. Post-Heilung Pflege von Embryonen
Hinweis: Transplantationen heilen innerhalb von ~ 30 min einrastet, und es ist normal, dass einige yolky Trümmer aus Zelle Lysis strahlt aus dem Embryo (Abbildung 3) zu beobachten.
<ol><li>
Sobald geheilt, verwenden einer Pasteurpipette sehr sanft Transfer Embryonen aus den Vertiefungen zu einzelnen Wells eine Agarose-beschichteten 24-Well-Platte. Das Exsudat werden (Abbildung 3D) durch Flüssigkeit mischen während der Übertragung entfernt.
	<ol>
<li>Drehen Sie die Embryonen, so dass sie pflanzliche-polig, mit Blick auf die Bulk-Lösung gelegt werden. Wieder, legen Sie die Spender-Kadaver und Transplantat-Empfänger im benachbarten Brunnen, bei der Verfolgung der Embryo Paare; Zeichnen Sie diese Informationen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die 24-Well-Platte mit Embryonen bis 25 ° C-Inkubator für Übernachtung Kultur. Hinweis: Am nächsten Tag die Embryonen werden Tailbud Stufen erreicht haben.</li>
	<li>Verschieben Sie die Transplantat-Empfänger zu reinigen Agarose-beschichteten 6-Well-Platten mit 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL, mit 1 Embryo pro Bohrloch ergänzt. Pflegen Sie einen klaren Datensatz der Spender Schlachtkörper, die diese entsprechen Transplantat-Empfänger.</li>
	<li>Bewerten Sie Mutagenese Effizienz durch Sequenzierung PCR Amplifikate5,17,24 oder mit anderen Methoden, die auf PCR Amplifikate verlassen (siehe Diskussion), bewegen Sie einzelne Schlachtkörper nach 0,2 mL PCR-Streifen Röhren Entfernen Sie die meisten des Mediums und homogenisieren in 100 µL Lyse Puffer24 mit Proteinase K (PK) durch wiederholte wechselvollen Pipettieren mit einer Pipette P200.</li>
	<li>Führen Sie Embryo Lyse24 bei 56 ° C für 6 h über Nacht um PK Verdauung zu ermöglichen. PK zu inaktivieren, durch Erhitzen auf 90-95 ° C für 10 min, gefolgt von schnellen Abkühlung auf 4 ° C. Verwenden Sie Lysates ohne weitere Bereinigung Schritte der PCR-Reaktionen zu kurzen Amplifikate für direkte DNA Sanger-Sequenzierung24säen. Speichern der Lysates bei-20 ° C. Hinweis: Innerhalb von einigen Tagen die Kaulquappen erreichen Fütterung Stadien (etwa Stufe 45-46) und eine Aussetzung der planktonischen Pulver (Sera Micron) eingespeist werden können.</li>
	<li>Bewegen Sie nach ~ 1 Woche mit täglichen Änderungen Kulturmedium Sauberkeit und mikrobielle Überwucherung zu minimieren Kaulquappen zu kleinen Tanks in einer zirkulierenden aquatischen System mit Tropf-Fluss. Verwenden Sie die Sequenzierungsdaten Kaulquappen mit hocheffizient mutagenisierter PGCs von Kaulquappen mit geringerer Mutagenese Effizienz zu trennen. Sobald die Metamorphose abgeschlossen ist, die Froglets zum Bewegen der Erwachsenen aquatischen Systems im Labor Hinweis: Therapien entwickelt, von der nationalen Xenopus -Ressource (Marine Biology Laboratory Woods Hole, MA) bieten einen Leitfaden für Kaulquappe Fütterung29 und Erwachsenen Frosch Wartung30.</li>
</ol>

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Der Autor hat nichts preisgeben.

Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von pflanzlichen Gewebe mit PGCs. Transplantation PGCs in Verbindung mit Genom-Bearbeitung Technologien (z. B. CRISPR/Cas9) verwendet, um die Keimbahn ändern eines Tieres während fast alle seiner somatischen Gewebe aufrechtzuerhalten als genetisch Wildtyp. Für Leap Frogging um erfolgreich zu sein, gibt es eine Reihe von kritischen Faktoren, die vor der Durchführung darstellender Transplantationen.
Um den ...

Wie Genotyp Phänotyp kodiert wurde eine wichtige Frage in der Biologie seit der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln. Ein Verständnis für die Rolle der Gene, deren Regulation und Interaktionen innerhalb von Gen-Netzwerken und die Funktionen der codierte Produkte versprechen die Werkzeuge für Aufdeckung neue Biologie und bessernde Krankheitszustände. Mehr als die Hälfte ein Jahrhundert1seit der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, eine führende Modell für Studien zu den unterschiedlichsten Themen in grundlegende Biologie und Biomedizin, einschließlich die genetische Kontrolle der Entwicklung. Historisch hat die meiste Forschung auf Xenopus Allotetraploid Frosch, laevis, verwendet aber in jüngerer Zeit, aufgrund seiner Diploidie X. tropicalis wurde entwickelt als Amphibien genetisches Modell. Vollständige Genomsequenzen sind von beiden Xenopus Arten2,3zusammengestellt. Die "Frog-Community" ist jetzt an einem Wendepunkt angelangt wo ermöglicht grundlegende Genom Änderung Technologie das Studium der Genfunktion, praktisch nach Belieben. Programmierbare CRISPR/Cas9 jedoch haben die Mutagenese von Genen hocheffizient mit biallelische Mutationen möglich in den meisten Zellen der Tier4,5,6,7gemacht, 8,9,10,11. Diese Studien, untermalt von Bhattacharya Et al. 12 und Shigeta Et al. 13, haben gezeigt, dass die Funktion vieler Gene durch Mutagenese in F0 Mosaik Tiere untersucht werden kann. Dieser Ansatz hat viele Vorteile; Cas9-SgRNA-mikroinjiziert Embryonen werden jedoch oft Variable Phänotypen aufgrund unvollständiger Funktionsverlust (LOF) angezeigt. Noch bedeutsamer ist, die Generation der mutierten Linien ist ein großer Vorteil für einige Anwendungen – insbesondere bei der Gene, die einen mütterliche mRNA-Beitrag zu studieren. Mütterliche mRNAs und Proteine und ihre Einflüsse auf die Epigenetik, bleiben über einen längeren Zeitraum in Embryogenese14,15,16, Darstellung der frühen Entwicklungsstörungen Beiträge vieler Gene feuerfeste F0 Analysen. Daher sind andere LOF Ansätze erforderlich.
Bei der Suche nach mutierten Linien zu erstellen, muss der Pfad auf die Erlangung von homozygot LOF Embryonen mehrere Hindernisse. Erste, effiziente Mutagenese biallelische Mutationen produzieren kann nachteilig sein, weil Verlust von wesentlichen Genfunktionen scheitern, Geschlechtsreife, stören die Herstellung einer tragfähigen Linie überleben führt. Eine gemeinsame Lösung ist die sorgfältige Titration der Höhe der Cas9-SgRNA geliefert. Hier ist das Ziel, ein Gleichgewicht zwischen reduziert Letalität bei gleichzeitiger Maximierung der Keimbahn Mutagenese Effizienz auch. Ein zweites Problem ergibt sich aus der standard Zucht-Schema, wo phänotypische Analysen bis F-2 -Generation aufgeschoben. Mit dem standard-Ansatz, sexuell Reifen Sie F0 Tiere, die Mutante zu übertragen, die Allele durch die Keimbahn outcrossed sind zur Herstellung F1 heterozygote "Träger", die dann zur Geschlechtsreife angebaut werden. Zwei F-1 -heterozygot sind dann intercrossed, um F2 mutierten Embryonen mit einer erwarteten Mendelian Frequenz von 25 % zu produzieren. So sind zwei Generationen der Zucht notwendig für die Analyse der Mutanten Phänotypen. Mutierte Tiere könnte entweder homozygoten oder compound-heterozygot (d. h. nachkommen, enthält zwei verschiedene mutierten Allele, die abhängig von der Genotypen der Elterntiere in der F1 Intercross verwendet).
Diese Hindernisse können überwunden werden, durch die Beschränkung programmierbare Nuklease-vermittelten Mutagenese, Keimzellen, die eine neue Methode namens sprunghaften17zugrunde liegt. Leap Frogging besteht aus zwei Hauptkomponenten: (1) die Mikroinjektion von Cas-mRNA zusammen mit SgRNA oder Nuklease-SgRNA-komplexe (oder, im Prinzip, TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen) Zeitpunkt der einzelligen effizient embryonale Genom mutagenize, gefolgt von (2) die Transplantation von PGCs auf Wildtyp Geschwister Embryonen, wo die endogenen PGCs entfernt wurden. Wenn beide Schritte sind effiziente und vollständige Keimbahn-Ersatz mit mutierten Keimzellen erhalten. Blackler bewiesen in den frühen 1960er Jahren, dass Xenopus PGCs zwischen den Embryonen im späten Neurula und frühen Tailbud Stufen18,19transplantiert werden konnte. Für Leap Frogging, wurde Blacklers Ansatz modifiziert durch Ausführen der Transplantationen im Blastozystenstadium Stufe17, wenn PGCs im Vegetal Pol der Embryo20,21lokalisiert sind. Transplantation vor Gastrulation hat zwei wesentliche Vorteile. Zunächst fand das Engraftment Transplantationen und die anschließende normale Entwicklung effizienter sein, wenn die Transplantation im Blastozystenstadium (unveröffentlichte Beobachtungen) durchgeführt wird. Zweitens durch Blastozystenstadium Transplantationen durchführen, kurz nachdem zygotic Transkription begonnen hat, vermeiden man die Letalität aus Entwicklungsstörungen Gen-Mutationen, die Gastrulation oder das stören sonst zu fehlerhaften späten Neurulae führen. PGC Transplantation-Lager ("leapfrogged") Embryonen sind gewachsen, Geschlechtsreife und Intercrosses zwischen diesen F0 Tieren haben gezeigt, dass in vielen Fällen 100 % der F-1 -Nachkommen den LOF-Phänotyp (die meisten werden zusammengesetzte anzeigen Heterozygoten), komplette Keimbahn Ersetzung durch gezielte Mutationen angibt.
Es wird erwartet, dass Leap Frogging gentechnische Ansätze im Xenopusbeschleunigen wird. Leap Frogging bietet auch eine Alternative zu den "host-Transfer" Methode22 für die LOF-Analyse von Genen mütterlicherseits-Effekt (unveröffentlichte Beobachtungen). In der aktuellen Publikation präsentiert eine detaillierte Beschreibung der Methode, vor allem mit Schwerpunkt auf PGC Transplantation, in X. tropicalis (mit geringfügigen Änderungen für laevis). Die Transplantation von PGCs beweist hier um einen schnelleren Transfer dieser Technologie an andere Laboratorien arbeiten mit Xenopuszu erleichtern. Die Prinzipien dieser Methode sollte erfolgreich in anderen Amphibien (z.B. Urodeles) und Organismus-spezifische Änderungen in der Methodik dürfen für die Anwendung auf vielen anderen Tieren, die in der effizienten Mutagenese erreicht werden kann und PGCs sind leicht transplantierbaren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

Die Schaffung von mutierten Linien von Genom-Bearbeitung beschleunigt genetische Analyse in vielen Organismen. CRISPR/Cas9 Methoden wurden für den Einsatz in der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, langjährige Modellorganismus für die biomedizinische Forschung angepasst. Klassische Züchtung Regelungen für die Erstellung von homozygoter Mutante Linien mit CRISPR/Cas9-gezielte Mutagenese haben mehrere zeitaufwändige und mühsame Schritte. Zur Erleichterung der Schaffung von mutierten Embryonen, besonders um die Hindernisse, die Gene, die für die Embryogenese, ausschlagen zugeordnet wurde eine neue Methode namens Leap Frogging entwickelt. Diese Technik nutzt die Robustheit des Xenopus Embryonen "Ausschneiden und einfügen" embryologischen Methoden. Leap Frogging nutzt die Übertragung der primordialen Keimzellen (PGCs) aus effizient mutagenisierter Spender Embryonen in PGC abgetragen Wildtyp Geschwister. Diese Methode ermöglicht die effiziente Mutation des wesentlichen Gene durch die Schaffung von Chimären Tiere mit Wildtyp-Körperzellen, die ein mutiertes Keimbahn tragen. Wenn zwei F0 Tiere tragen "leapfrog Transplantationen" (d. h. mutierten Keimzellen) sind intercrossed, sie produzieren homozygote oder compound heterozygote, null F1 Embryonen, spart eine ganze Generationszeit, phänotypische Daten zu erhalten. Leap Frogging bietet auch einen neuen Ansatz für die Analyse von mütterlicher Effekt Gene, die refraktär gegenüber F0 phänotypische Analyse nach CRISPR/Cas9 Mutagenese sind. Dieses Manuskript beschreibt die Methode der Leap Frogging, mit besonderem Schwerpunkt auf PGC Transplantation erfolgreich durchführen.

Nach Transplantation sollte die qualitative Bestimmung der Wirksamkeit von CRISPR/Cas9 Mutagenese vor Aufwendung den Aufwand bei der Tierhaltung zu wachsen und pflegen die Tiere zur Geschlechtsreife durchgeführt werden. Weil Tiere tragen Leapfrog Transplantationen somatisch Wildtyp sind und Keimbahn für direkte Messungen schwer zugänglich ist, wird das speichern die Kadaver von Spender-Embryonen wichtig. DNA-Analyse aus Kadavern dient als Proxy für den Umfang der Mutagenese, die in de...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Aufrufe.  University of California, Irvine. Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Serie: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...