Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, den Prozess der Bildung des Gefäßnetzwerks auf klare und leicht nachvollzugbare Weise zu untersuchen, die Türen für neue Studien zu öffnen und das Verhalten der Blutgefäße zu beleuchten. Diese Technik bietet die Möglichkeit, hochorganisierte und wiederholbare vaskuläre Netzwerke zu erzeugen, die auf die Umgebung reagieren. Endothelzellen von Patienten, die an einer Gefäßerkrankung leiden, können mit diesem System entnommen werden, wodurch es möglich ist, die Gefäßerkrankung nachzubilden und eine geeignete Behandlung zu finden.
Die vorgeschlagene Methode kann erweitert werden, um das Verhalten von vaskulären Netzwerken zu untersuchen, wenn sie mit verschiedenen Zelltypen gepaart wird, so dass die Interaktion von sich entwickelnden Gefäßen mit einem bestimmten Gewebetyp beobachtet werden kann. Beginnen Sie, indem Sie die Gerüste für mindestens 15 Minuten in 70% Ethanol tauchen und dann zweimal in PBS waschen. Mischen Sie 1,5 Mikroliter Fibronektin-Stammlösung mit 28,5 Mikrolitern PBS pro zu säendem Gerüst.
Bereiten Sie eine Fibronektinverdünnung vor, die für alle Gerüste verwendet wird, um Pipettierfehler zu vermeiden. Stellen Sie die Gerüste spärlich auf eine hydrophobe Oberfläche und bedecken Sie jedes Gerüst mit 30 Mikrolitern der Fibronektinverdünnung. Ersetzen Sie den Deckel der Platte und legen Sie die mit Fibronektin bedeckten Gerüste für mindestens eine Stunde in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 100% Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.
Nach der Inkubation die Gerüste in PBS leicht ausspülen, um Fibronektinreste zu entfernen. Die Gerüste können bis zu einer Woche in PBS bei vier Grad Celsius gehalten werden. Bereiten Sie Endothelzellen oder EC-Medium vor, indem Sie das Basalmedium mit den entsprechenden Medium-Kit-Komponenten mischen, einschließlich einer Antibiotikalösung, FBS und Endothelzellwachstumspräparaten, wie vom Hersteller angegeben.
Machen Sie die humane fette mikrovaskuläre Endothelzellsuspension in EC-Medium mit einer Konzentration von vier Millionen Zellen pro Milliliter. Legen Sie mit einer Zette ein fibronektinbeschichtetes Gerüst pro Vertiefung in eine Nicht-TC 24-Well-Platte. Decken Sie jedes Gerüst mit 25 Mikrolitertröpfchen der Zellsuspension ab und achten Sie darauf, dass die Suspension nicht vom Gerüst abfließt.
Legen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie ihn für 60 bis 90 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation jede Vertiefung mit 700 Mikrolitern EC-Medium füllen. Inkubieren Sie die endothelialisierten Gerüste, bis der EC-Zusammenfluss mit Fluoreszenzmikroskopie oder für drei Tage beobachtet werden kann.
Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Bereiten Sie DPSC-Medium vor, indem Sie 500 Milliliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, 57,5 Milliliter FBS, 5,75 Milliliter nicht essentielle Aminosäuren, 5,75 Milliliter GlutaMAX und 5,75 Milliliter Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung mischen. Übertragen Sie die endothelialisierten Gerüste in eine neue Nicht-TC 24-Well-Platte.
Entsorgen Sie alle Medien von der aktuellen Platte mit einer Pipette oder Vakuumabsaugung und achten Sie darauf, kein Vakuum direkt auf das Gerüst anzuwenden. Stellen Sie ein Gerüst in die Mitte jedes Brunnens und trocknen Sie dann die Umgebung mit leichtem Vakuum. Thrombin- und Fibrinogen-Stammlösungen mit PBS auf eine Endkonzentration von fünf Einheiten pro Milliliter bzw. 15 Milligramm pro Milliliter verdünnen.
Bereiten Sie eine acht Millionen DPSC pro Milliliter Suspension in der Thrombinverdünnung vor und verteilen Sie 12,5 Mikroliter der Suspension in einzelne Mikroröhrchen pro Gerüst, um ausgesät zu werden. Stellen Sie eine Pipette mit fünf bis 50 Mikrolitern auf 12,5 Mikroliter und füllen Sie sie mit Fibrinogenlösung. Ohne die Spitze zu entfernen, stellen Sie die Pipette auf 25 Mikroliter ein.
Das Material in der Spitze sollte aufsteigen und ein leeres Volumen hinterlassen. Drücken Sie langsam den Kolbenknopf, bis die Flüssigkeit die Spitzenöffnung erreicht, aber nicht austritt. Halten Sie den Kolben in dieser Position und stecken Sie die Spitze in eine der Mikrozentrifugenröhrchen, die die Zellen in Thrombinsuspension enthalten, um sicherzustellen, dass die Spitze mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt.
Lösen Sie vorsichtig den Kolbenknopf und ziehen Sie die Zellaufhängung in die Spitze. Mischen Sie beide Materialien gründlich und vermeiden Sie Blasenbildung. Dosieren Sie die gemischten Materialien schnell auf einem endothelialisierten Gerüst.
Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für jedes Gerüst und stellen Sie sicher, dass Sie die Spitzen zwischen den Anwendungen wechseln, um unerwartete Fibringelbildung innerhalb der Spitze zu vermeiden. Ersetzen Sie den Plattendeckel und inkubieren Sie die Gerüste bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit für 30 Minuten. Füllen Sie nach der Inkubation jede Vertiefung mit einem Milliliter EINS-zu-Eins-DPSC- und EC-Medium.
Kultur für eine Woche, wechselt das Medium jeden zweiten Tag. Entfernen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur das Medium aus dem Brunnen und stellen Sie die Konstrukte mit einem konfokalen Mikroskop dar, um die vaskuläre Entwicklung oder einen anderen interessierenden Parameter zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von tessellierten Gerüsten aus SU-8 Fotolack.
Gerüste mit unterschiedlichen Kompartimentgeometrien und hochgenauen und wiederholbaren Merkmalen wurden erhalten. Bei der traditionellen gleichzeitigen Aussaat von Endothelzellen und Stützzellen wurden die Zellen homogen über das Gerüst verteilt, was zu unvorhersehbaren und unorganisierten vaskulären Netzwerken führte. Im Gegensatz dazu führte die schrittweise Zellaussaat zu hochorganisierten vaskulären Netzwerken.
Bei Verwendung fluoreszierender Endothelzellen können die Gefäße in Echtzeit abgebildet werden. Rot fluoreszierende Protein-exprimierende Endothelzellen wurden auf hexagonalen Gerüsten kultiviert und abgebildet. Die Stützzellen wurden am ersten Tag hinzugefügt und die vaskulären Netzwerke wurden jeden zweiten Tag abgebildet, um die Gefäßentwicklung zu quantifizieren.
Für jeden Zeitpunkt wurden breite Bilder des gesamten Gerüsts aufgenommen. Das Schiffswachstum wurde als Gesamtschiffslänge und -fläche quantifiziert. Ein konfokale Bildgebungszeitraffer wurde durchgeführt, um die Verfolgung einzelner Gefäße mit mehrfarbigen Endothelzellen zu ermöglichen.
Der Schiffspfad wurde aus dem Zeitraffer generiert, so dass die Schiffsmigration beobachtet werden konnte. Die Gefäßreifung wurde durch das Vorhandensein von Aktin- und Stützzellen der glatten Muskulatur beobachtet. Für die kreisförmigen, sechseckigen und quadratischen Kompartimente vermehren sich die Zellen und organisieren sich zu Strukturen.
Am siebten Tag zeigten alle Formen ein reiches und komplexes vaskuläres Netzwerk. Bilder mit höherer Vergrößerung zeigten ein dichteres Aktin der glatten Muskulatur und eine Unterstützungszellpräsenz, die mit gebildeten Gefäßen kollokalisiert ist, was die Rekrutierung und Differenzierung von Unterstützungszellen um vaskuläre Strukturen zeigt. Diese Technik kann verwendet werden, um das Verhalten dreidimensionaler vaskulärer Netzwerke zu untersuchen, wenn sie verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, z. B. spezifischen Zellinhibitoren oder in Gegenwart zusätzlicher Zelltypen.
