Diese Methode kann helfen, die räumlich zeitliche Regulierung eines Gens von Interesse während dynamischen biologischen Ereignis wie Immunität in intakten Arabidopsis Blättern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, die räumlich zeitliche Dynamik der Promotoraktivität in Boden gewachsenen intakten Pflanzenblättern über wenige Tage zu erfassen. Um dieses Verfahren zu beginnen, füllen Sie eine Kunststoff-Zell-Steckerschale mit autoklavierten Boden.
Säen Sie eine transgene Arabidopsis Samen in jede Zelle. Übertragen Sie das Tablett in einen Wachstumsraum, der bei 23 Grad Celsius gehalten wird, und wachsen sie die Pflanzen unter kontinuierlichen Weißlichtbedingungen für zwei bis drei Wochen. Zwei Tage vor der Inokulation des Erregers, streifen Sie den Erreger, der avrRpt2 von einem Glycerin-Bestand auf nyG-Medium trägt, das Rifampicin mit 100 Milligramm pro Liter und Kanamycin bei 50 Milligramm pro Liter enthält.
Inkubieren Bei 28 Grad Celsius für 48 Stunden. Mit Plastikspitzen die Bakterienzellen ernten, die auf der Oberfläche des Mediums erscheinen. Übertragen Sie die Bakterien in ein Kunststoffrohr, das 10 MilliMolar Magnesiumchlorid enthält, und suspendieren Sie sie.
Messen Sie dann die optische Dichte der Lösung bei 600 Nanometern. Passen Sie die Endkonzentration der Bakterienzellen auf 100 Millionen koloniebildende Einheiten pro Milliliter an, was normalerweise einem OD600 von 0,2 entspricht. Schneiden Sie zunächst vorsichtig einen Zellstecker aus, der eine zwei bis drei Wochen alte Pflanze enthält und so achtet, dass die Pflanze nicht beschädigt wird.
Legen Sie die Zelle in einem leeren Zellensteckerabteil fest, um eine gute Balance zu halten. Wählen Sie ein sichtbar gesundes Blatt für die Impfung. Feststellend, dass in der Regel der dritte, vierte und fünfte Blätter von der Unterseite der Pflanze sind einfach zu handhaben.
Gießen Sie den Boden, der die Pflanze vor der Impfung hält, um eine Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung zu erzielen. Optional, bei der Analyse stressresponsive Promoter untersuchen die Blätter unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop vor der Pathogen-Impfung, um das Fehlen von YFP-Signal zu überprüfen. Als nächstes legen Sie Einweg-Latexhandschuhe an, um direkten Kontakt mit dem Erreger während der Infiltration zu vermeiden.
Mit einer ein Milliliter nadellosen Kunststoffspritze die abaxiale Seite des Blattes vorsichtig mit der bakteriellen Suspension infiltrieren. Die Impfung eines kleinen Teils auf der Hälfte des Blattes ermöglicht eine gute Visualisierung der PR1-Promoteraktivität. Verwenden Sie ein weiches Papiertuch, um überschüssige bakterielle Suspension aus dem Bereich um den infiltrierten Bereich auf dem infiltrierten Blatt zu absorbieren.
Unmittelbar nach der Impfung verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um einen Glasschlitten an der Kunststoffschale so zu befestigen, dass sich das infiltrierte Blatt in der Mitte des Glasschlittens befindet. Stellen Sie sicher, dass die geimpfte Blattklinge vollständig in der Glasrutsche montiert ist. Schneiden Sie ein Stück doppellagiges Kunststoffband in zwei Stücke, um die Räume entlang der Petiole des infiltrierten Blattes zu passen, und schneiden Sie eine Ecke von jedem Stück.
Mit einer feinen Pinzette kleben Sie diese Klebebänder auf beiden Seiten der Blattbals, so dass die geschnittenen Ecken jedes Stückes an der Basis der Blattklinge ausgerichtet sind, um sicherzustellen, dass die Bandstücke die Blatt- oder Blattklinge nicht berühren. Als nächstes bereiten Sie ein zusätzliches Stück doppelschichtiges Kunststoffband vor, wie in Abbildung 2 des Textprotokolls beschrieben. Kleben Sie dieses Stück Klebeband auf die zuvor haftenden Stücke, um eine Brücke über die Petiole zu bilden, wobei Sie darauf achten, die Blatt- oder Blattklinge nicht direkt zwischen den Bandstücken zu fangen.
Dann kleben Sie vorsichtig ein kleines Stück OPERATIONSband auf die Glasrutsche über der Spitze der Blattklinge, so dass es sehr weich auf dem Schlitten befestigt wird. Drücken Sie fest auf den Teil des Bandes, der die Glasrutsche direkt berührt. Legen Sie vorsichtig ein weiteres kleines Stück OPERATIONSband an den Rand der Petiole- und Kunststoffbandstücke, so dass das Blattblatt sehr weich auf dem Glasschlitten und Kunststoffbandstücken befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass nur der Teil des chirurgischen Bandes, der den Glasschlitten oder die Kunststoffbandstücke direkt berührt, fest befestigt wird.
Legen Sie 200 Mikroliter Pipettenspitzen sanft in den Boden, um die benachbarten Blätter sanft vom infiltrierten Blatt wegzuhalten. Schalten Sie zunächst das fluoreszierende Stereomikroskop ein. Stellen Sie die Pflanze unter der Objektivlinse des Stereomikroskops für die Bildgebung in den Raum ein.
Richten Sie die Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung ein. Verwenden Sie den herkömmlichen YFP-Filter, um das YFP-Signal zu visualisieren. Verwenden Sie den Texas Red-Filter, um die Chlorophyll-Autofluoreszenz so zu visualisieren, dass die PCD-Domäne als dunkler Bereich sichtbar ist, der von YFP-positiven Zellschichten umgeben ist.
Als nächstes verwenden Sie die herkömmliche epihelle Feld-Setup für zusätzliche Lichtbelichtung Schritte, um sicherzustellen, Schritte für Lichtbelichtung während des Intervalls der Zeitraffer-Bildgebung zu programmieren, da Licht einen großen Einfluss auf die Pflanzenimmunität hat. Führen Sie das Zeitraffer-Imaging-Programm aus. Für eine Langzeitbeobachtung über mehrere Tage sollten Sie die Anlage entsprechend gießen.
Lassen Sie nach der Bildaufnahme zusätzliche Kanäle aus, die für die Lichtbelichtung in den Intervallen des Datensatzes verwendet werden. Analysieren Sie die Daten mithilfe von Bildanalysesoftware mit verschiedenen Methoden, z. B. der Analyse der Interessenregion. In dieser Studie wird eine vielseitige Methode zur Montage von Arabidopsis-Blättern für intravitale Zeitraffer-Bildgebung demonstriert.
Ein repräsentatives Beispiel für Zeitraffer-Bilddaten mit avrRpt2-induziertem ETI wird sowohl als Bildfolge als auch als Zeitrafferfilm erhalten. In erfolgreichen Experimenten mit pPR1-YPF-NLS während avrRpt2-induziertem ETI wird eine transiente Aktivierung des PR1-Promotors beobachtet, wie aus YFP-Exziten und mehreren Zellschichten, die die PCD-Domäne umgeben, ersichtlich ist. Die Aktivierung des PR1-Promoters in Zellen, die die PCD-Domäne umgeben, beginnt in der Regel bei etwa fünf Stunden nach der Impfung, erreicht spitzen Werte bei etwa 12 Stunden nach der Impfung und dauert bis zu 40 Stunden nach der Impfung.
Bei diesem Versuch müssen die Zeitrafferbedingungen sorgfältig festgelegt werden, wie im Text beschrieben. Nach diesem Verfahren kann die Promotoraktivität mit Hilfe von Analysesoftware quantitativ und qualitativ analysiert werden. Diese Analyse hilft uns, die raumzeitliche Dynamik der Genexpression in jedem biologischen Ereignis zu erforschen, das in lebenden Blättern von Arabidopsis-Pflanzen auftritt.
