Die Autoren möchten Drs danken. Philine S. Lee und Alan D. Grossman für zunächst Ausbildung LAS in der Fluoreszenzmikroskopie. Die Autoren danken Drs. Melanie Berkmen und Hajime Kobayashi um Hilfe und Tipps für die Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem College of Literature, Science &amp; Arts und vom Department of Molecular, Cellular, und Entwicklungsbiologie an der University of Michigan unterstützt.

Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie 1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden. <ol class="ualpha"><li> Für einige B. subtilis-Stämme (insbesondere Stämme, die schlecht wachsen, durch die Integration der translationale Fusion zwischen dem Gen von Interesse und GFP in seiner endogenen Locus), anfängliche Wachstum für zwei Tage vor der Bildgebung ist notwendig für qualitativ hochwertige Bilder. Am ersten Tag, Streifen der B. subtilis-Stamm, auf LB-Agar mit selektiven Antibiotikum (s) abgebildet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am zweiten Tag, impfen 100 ul von 0,85% Kochsalzlösung mit einer einzelnen Kolonie, und führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten (mit selektiven Antibiotika), Plattieren 100 ul jeder Verdünnung durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Am dritten Tag, wählen Sie die Verdünnung Platte mit Licht konfluenten Wachstum der Zellen. Licht konfluenten Wachstum auf einer Platte wird das Nährmedium mit einer gesunden, exponentiell wachsenden Starter Inokulum potenziell ergeben exzellente Bildergebnisse (siehe Schritt 4) liefern. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die höchste Qualität Membran-Bildgebung mit der Fleck FM4-64. </li><li> Andere B. subtilis-Stämmen kann einfach auf selektive LB-Agar-Medium für einzelne Kolonien mit einer sterilen Stick am Tag vor der Bildgebung angewendet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am folgenden Tag werden die Zellen auf dieser Platte ausreichend sein, um als Inokulum für die Bildgebung zu verwenden (siehe Schritt 4). HINWEIS: B. subtilis, werden über Nacht Kulturen in flüssigem Medium nicht angemessen auf eine Kombination der Sporenbildung und die Beschlussfähigkeit Antworten, die über einen längeren Zeitraum Lag-Phase Wachstum 1 führen wird. </li></ol> 2. Am Morgen des Imaging, 10 ml S7 50 3.1 Medium in einem 125 ml sterilen Erlenmeyerkolben. 3. Resuspendieren der Zellen in bis zu 2 mL der S7 50 mittelgroßen aus dem LB-Agar-Platte mit einzelnen Kolonien oder das Licht konfluenten Zellen zu einem Inokulum erhalten. 4. Fügen Sie genug S7 50 mittelgroßen Zelle Inokulum auf die Erlenmeyerkolben mit 10 mL S7 50 mittelgroßen für eine Kultur mit einer anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD 600) von ~ 0,08 bis 0,1. Bei diesem Schritt ist es wichtig, mindestens eine 10-fache Luft bis mittlere Verhältnis haben. So verwenden wir 10 bis 12,5 ml beimpft Medium in einem 125 mL Erlenmeyerkolben. 5. Wachsen jeder Kultur bei 30 ° C bis die Kultur eine OD 600 erreicht ~ 0,5-0,8. Schüttelwasserbäder mit Umdrehungen pro Minute 150 bis 200 bevorzugt. Kulturen mit DNA-schädigenden oder mismatch induzierende Mittel herausgefordert sollten in einem frühen exponentiellen Wachstumsphase werden OD 600, so dass die Zellen das Ziel zu erreichen OD 600 mit der zusätzlichen Zeit des Wachstums, die für die Behandlung erforderlich ist (siehe Tabelle 1) Zum Beispiel erfordert 2-Amino einer Stunde Behandlung und damit eine Kultur mit 2-Amino behandelt werden, sollten bei OD 600 ~ 0,3-0,4 werden, so dass die eine Stunde Behandlung / Wachstum führt zu einer OD 600 ~ 0,5-0,8, wobei Zellen sind bereit für die Bildgebung. Probenvorbereitung 1. Pipette 300 pl kultivierten Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. 2. Wenn Bildgebung von Zell-Membranen gewünscht wird, fügen 1:1000 Verdünnung von FM4-64 Membran-Färbung (Invitrogen) zu jeder Probe aus einer 1 mg / ml Stammlösung. Eine Titration von FM4-64 erforderlich, um die gewünschte Fluoreszenz-Signal zu erzielen. Ein typisches Titration Bereich liegt bei 1:100, 1:1000 und 1:10.000. 3. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur für bis zu 10 Minuten oder zu sitzen, während die Folie wird mit 1% Agarose in 1X Spizizens Medium hergestellt, wie unten beschrieben (siehe Schritt 1 unter &quot;Präparat&quot;). 4. Wenn die Konzentration der Zellen erforderlich ist, bevorzugen wir Filterung Zellen unter Verwendung eines 0,2 um-Filter mit einer Vakuumapparatur. Die Zellen können dann leicht von der Oberfläche des Filters mit PBS, eine andere geeignete Puffer oder Medium vor Visualisierung gewaschen werden. Slide Vorbereitung 1. Bereiten Sie 1% Agarose mit 1X Spizizens. 5 ml 10X Spizizens Lager bis 45 ml ddH2O zusammen mit 0,5 g Agarose und Mikrowelle zu schmelzen. Hot geschmolzene Agarose ist schwierig, Pipette, und erstarrte Agarose wird nicht in die Pipettenspitze. Die Agarose sollte in einem Wasserbad äquilibriert auf eine Temperatur von ~ 55-65 ° C für sie die Pipettenspitze geben, ohne Verfestigung in der<html> tip. 2. Draw 20 ul Spizizens mit 1% geschmolzener Agarose in die Pipettenspitze. Pipette einen Tropfen (etwa 1-2 ul) der Agarose-Lösung in jede Folie gut (wir benutzen 15-gut gleitet, siehe Tabelle 2) zu seicht Agarose Pads bilden. Die Agarose wird sofort erstarren. Folien müssen auch unmittelbar vor der Applikation der Zellen sein. Wenn die Agarose Pads bei Raumtemperatur allein gelassen werden, können sie innerhalb weniger Minuten austrocknen und unbrauchbar werden. Agarose-Pads sollten zentriert und füllen jedes Loch aber minimale Höhe zu verhindern, dass das Deckglas, wenn Tröpfchen sind zu hoch (bubble-like) oder wenn die Probe breitet sich über die gut Grenze, einfach streichen die auch sauber und mit einer Kimwipe und anwenden neue Agarose-Pad. 3. Übernehmen Sie die gesamte 300 ul Probe (siehe Schritt 6), um die Folie, auf der Oberseite jeder Agarose Pad verteilt. Diese Menge an Zellen sollte ausreichen, um jedes Loch auf der Folie abdecken. 4. Lassen Sie die Folie mit Zellen geladen werden, um bei Raumtemperatur stehen lassen (23 ° C) für etwa 10 Minuten. Dieser Schritt wird für die Zellen auf dem Agarose-Pad zu unbeweglich und bereit für die Bildgebung niederlassen können. Für spezielle Bedürfnisse dieser Temperatur müssen möglicherweise geändert werden, zum Beispiel werden bei der Durchführung von Experimenten, die einen Temperatur-Shift 4 erfordern. 5. Absaugen entfernt das überschüssige Medium aus jeder Vertiefung, ohne die Pads selber. 6. Wenden Sie das Deckglas auf die Folie, Pressen fest und gleichmäßig, aber vorsichtig, über den Bereich der Folie. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas vor dem Schlitten und dass das Deckglas ist nicht über die Folie angehoben wird. Visualisierung von Zellen 1. Viele verschiedene Fluoreszenz-Mikroskopen wird gut funktionieren. Es ist wichtig, zu einem 100X Ölimmersion haben. Die Simmons Lab verwendet: <ul><li> Olympus BX61 Mikroskop mit 1,45 NA TIRFM 100X Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD gekühlte Kamera </li><li> Lumen 200 Bogen Metall (Vor-) Lichtquelle. </li><li> Für die Detektion von GFP (FITC), Filter Anregung 460-500 und 510-560 Emission </li><li> Für den Nachweis von FM4-64 (TRITC), Filter Anregung 510-560 und 572-648 Emission. </li><li> Die Bilder wurden aufgenommen mit SlideBook 4,2 (Abbildung 1) </li></ul> 2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus mit weißem Licht. 3. Nehmen Sie das Bild mit Hilfe geeigneter Filter für jedes Fluorophor. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder angezeigt werden (Abbildung 1). GFP Brennpunkte sollte gut definiert, während FM4-64-Färbung sollte hell und klar, 4-7. GFP oder Membran Bilder können pseudo-farbig mit einer beliebigen Farbe, um die höchste Bildqualität, ohne dass Daten verloren gehen vorgestellt werden können. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Repräsentative GFP Bilder von B. subtilis translationale Fusionsproteine. GFP-Proteine ​​sind in grün dargestellt, während FM4-64 Membranfärbung in rot dargestellt wird. Der weiße Maßstab zeigt 3 mu m (A) MutS-GFP [relevant Genotyp: mutS - gfp (SPC), amyE: Pspac mutL (cat)]. In Gegenwart von 600 ug / mL 2-Amino-und 1 mM IPTG. FM4-64-Signal wird nicht dargestellt, um deutlicher zu zeigen, die MutS-GFP Brennpunkte (B) MutL-GFP [relevant Genotyp: mutL: mutL-GFP (SPC)].. In Gegenwart von 2-Amino (C) DnaX-GFP [relevant Genotyp: DnaX: DnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevant Genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] in Gegenwart von 20 ng / mL Mitomycin C (E) tagC-GFP [relevant Genotyp: tagC: tagC-GFP (SPC) ] in Gegenwart von 1 pg / mL Mitomycin C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Treatment / Konzentration oder Menge </td><td> Funktion </td><td> Die Zeit der Inkubation </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20 bis 150 ng / mL] </td><td> DNA Alkylierungsmittel </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> 2-Amino (2-AP) [600 ug / mL] </td><td> Missverhältnis zu induzieren </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> erschöpft dNTPs </td><td> 3 Stunden </td></tr><tr><td> ultraviolettem Licht (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymin-Thymin-Dimeren und 6-4 Photoprodukte </td><td> variiert je nach Quelle, in der Regel 20 Sekunden </td></tr><tr><td> Grau (ionisierende Strahlung) von 5 bis 100 Gy </td><td> Doppelstrangbrüche, Einzel-Strangbrüchen und Grundschaden Websites </td><td> variiert je nach Quelle </td></tr></tbody></table>&quot;&gt; Tabelle 1. Zusammenfassung von DNA-schädigenden und Mismatch induzierenden Behandlungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Multitest Rutsche, 15-gut </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12 bis 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fischer </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, Handschuhe tragen </td></tr><tr><td> 2-Amino </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> lichtempfindlich </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte:

<ol>
	<li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle.">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis.">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li><li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis.">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li><li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis.">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction.">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li><li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells.">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li></ol>

Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Gr...

Spezielle Lösung Rezepte 1: 10x S7 50 Salze 0,5 M MOPS 100 mM Ammoniumsulfat 50 mM Kaliumphosphat Einbasisches Filter sterilisieren, und wickeln S7 50 Medien in der Folie vor der Lagerung 100x Metals 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0,1 mM ZnCl 2 100 ug / ml Thiamin HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O auf Endvolumen * FeCl 3 dauern sollte hinzugefügt werden, um Niederschlag zu verhindern. Nach Sterilfiltration, wickeln 100x Metall-Lösung in Folie. S7 50 Medien 1x S7 50 Salze 1x Metall 1% Glucose 0,1% Glutamat 40 ug / mL Tryptophan 40 ug / mL Phenylalanin destilliertem H 2 O auf Endvolumen 10x Spizizens (g / L) 151,4 mM Ammoniumsulfat (20 g / L) 803,8 mM Kaliumphosphat Einbasisches (140g / L) 440,9 mM Kaliumphosphat dibasisch (60g / L) 34,0 mm Natriumcitrat (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / l) dH 2 O auf Endvolumen Filter sterilisieren

imaging mismatch repair and cellular responses to dna damage in bacillus subtilis

Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine ​​und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine ​​an ihre spezifischen Läsionen<em&gt; In vivo</em&gt; Und zu verstehen, wie diese Proteine ​​in bakteriellen Zellen organisiert sind. Darüber hinaus haben der Transkription und Translation Fusionen im Zusammenhang mit DNA-Schäden Promotoren zeigten die Zellen innerhalb einer Population haben genotoxischen Stress-Reaktionen aktiviert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie zur Abbildung der Montage der DNA-Reparatur und DNA-Replikation Komplexe in einzelnen Bakterienzellen. Insbesondere konzentriert sich diese Arbeit auf die Bildgebung Mismatch-Reparatur-Proteine, die homologe Rekombination, DNA-Replikation und eine SOS-induzierbare Protein in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Alle hier beschriebenen Verfahren leicht zugänglich sind für die Bildgebung Protein-Komplexe in einer Vielzahl von Bakterienarten.

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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Zellen.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

10.9K Aufrufe.  University of Michigan-Ann Arbor. Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben Bacillus subtilis Zellen.

Serie: Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Forschung

Biologie

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...