Die Live-Zell-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse im Laufe der Zeit innerhalb einer einzelnen Zelle. Diese Ansätze sind mächtig, um die Bedingungen zu bewerten, die den dynamischen Prozess der Zellteilung beeinflussen, und die Auswirkungen auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von Tochterzellen aufzudecken. Phototoxizität, die sich aus der Lichtexposition während der Bildgebung ergibt, stellt eine bedeutende Herausforderung im Zusammenhang mit diesem Protokoll dar.
Daher sollten die Belichtungszeiten und das Bildgebungsintervall und die Bilddauer optimiert werden. Verwenden Sie mit aseptischer Technik und einem Sicherheitsschrank auf Biosicherheitsebene zwei eine sterile Einwegglas-Pasteurpipette, um das Medium aus der Kulturplatte zu saugen, die die Zelllinie enthält, die das Ausdruckskonstrukt von Interesse trägt. Waschen Sie die Zellen kurz mit 10 Millilitern steriler PBS mit Wirbeln und behandeln Sie die Zellen mit zwei Millilitern 0,05%Trypsin.
Nach zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius acht Milliliter frisches Medium auf die Platte geben, um die Reaktion zu stoppen und die abgetrennten Zellen mit sanfter Pipettierung wieder aufzuhängen. Übertragen Sie die Zelllösung in ein steriles 15-Milliliter-Rohr und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS wieder auf und zentrieren Sie die Zellen erneut.
Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter Medium zum Zählen aus und verdünnen Sie die Zellen auf ein bis zwei Mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter Zellkultur mittlerer Konzentration. Dann säen Sie 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer sterilen 12-Well-Bild-Bodenplatte und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, damit die Zellen an der Oberfläche der Platte haften können. Nicht mehr als 30 Minuten vor der Bildgebung, fügen Sie eine relevante Konzentration eines mitotischen Medikaments zu einem oder mehreren der Brunnen und fügen Sie ein gleiches Volumen des Inhibitor verdünnungsmittel, um die gleiche Anzahl von Brunnen wie die Kontrollen.
Um das Mikroskop für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie die Platte auf die Bühne eines invertierten Epifluoreszenzmikroskops, das mit einer hochauflösenden Kamera, einer auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Umweltkammer und einem Abgabesystem für befeuchtetes 5% Kohlendioxid ausgestattet ist. Wählen Sie ein 20-faches Luftobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,5 und ausgestattet für die kontrastreiche Fluoreszenz und den Phasenkontrast oder die Lichtfeldabbildung und sehen Sie die Zellen, um den Kurs anzupassen und den Fokus zu finden, um Zellen in den Fokus zu rücken. Um die optimalen Belichtungszeiten für die Bildaufnahme von Hellfeld, GFP und RFP einzustellen, wählen Sie die entsprechenden Filterwürfel mit der entsprechenden Anregung und Emission für die Fluorophore aus, die abgebildet werden, und klicken Sie auf Wiedergabe.
Wenn das Signal nicht intensiv genug ist, passen Sie die automatische Belichtung an und wählen Sie in jedem Fluorophorkanal die entsprechende Binning aus dem Dropdown-Menü Format aus. Wählen und kalibrieren Sie die Mikroskopstufe gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Multi-Well-Schale und verwenden Sie die Bildaufnahmesoftware, um die zu bebildernden Brunnen hervorzuheben oder anderweitig auszuwählen. Öffnen Sie das Bedienfeld "Generierte Punkte", und wählen Sie unter Arbeitsbereich Eingeschränkt und Rahmen aus, um den Koordinatenauswahlbereich einzuschränken, um die Grenzen des Brunnens auszuschließen.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Flächenbeschränkung die Option Ganzer Bereich aus, und wählen Sie eine zufällige Punktplatzierung aus. Legen Sie die Anzahl auf sechs fest, und klicken Sie auf Randomize, um die Anzahl und Verteilung der Punkte auszuwählen, die pro Brunnen erfasst werden sollen. Klicken Sie dann auf die Werte und geben Sie die Werte in das Zeitreihenbedienfeld ein, um das Zeitintervall und die Dauer für das Sammeln der Bilder auszuwählen und einzugeben.
Um das mit RFP-H2B beschriftete Chromatin zu visualisieren, wählen Sie die mit dem RFP-Filterwürfel aufgenommenen Bilder aus und identifizieren Sie eine Zelle, die mit der Mitose eintritt, wie die anfängliche Chromatinverdichtung und der Kernhüllenabbau zeigen, um das mitotische Timing der Metaphasenausrichtung und des Anaphasenbeginns in einzelnen Zellen zu bestimmen. Verfolgen Sie die Zelle von Interesse durch aufeinander folgende Zeitpunkte im erworbenen Film, um die Anzahl der Zeitpunkte oder Minuten vom mitotischen Eintrag zu bestimmen, bis RFP-H2B mit Chromatin als Chromatin die Ausrichtung am Zelläquator während der Metaphase abschließt. Um das mitotische Timing, die mitotische Treue und das Zellschicksal zu überwachen, verfolgen Sie die Zelle weiterhin durch aufeinander folgende Zeitpunkte, um die Zeitkoordinate zu identifizieren, bei der die Anaphase-Chromosomensegregation erkennbar ist und/oder wann Chromatin-Dekomprimierung und Kernhüllen-Reformation stattgefunden haben.
Visualisieren Sie dann RFP-H2B, um Zellen in jeder Population zu identifizieren, die mitotische Defekte aufweisen, einschließlich verzögerter Chromosomen und Chromatinbrücken während der Anaphasen-Chromosomensegregation. Durch die Visualisierung von Alpha Tubulin-EGFP kann beobachtet werden, dass Zellen, die spindeldellösen, dynamische Veränderungen erfahren, wenn Spindelzugfokussierung erreicht wird und eine bipolare mitotische Spindel zur Vorbereitung der Zellteilung gebildet wird. Gleichzeitig mit der Spindelbaugruppe kann die Chromosomenbewegung mit RFP-H2B visualisiert werden, um die Chromosomenausrichtung und Seigerungstreue zu bewerten.
Mit Hilfe von Live-Zell-Bildgebungsansätzen zeigen diese repräsentativen Ergebnisse, dass Zellen mit einem normalen Zentromatgehalt in der Lage sind, vom Kernhüllenabbau durch Metaphasenausrichtung und Anaphasenbeginn zu einer bipolaren Teilung in weniger als 30 Minuten zu gelangen. In Gegenwart von zusätzlichen Zentrosomen sind fast 50% der Zellen in der Lage, eine transiente multipolare mitotische Spindel zu überwinden und eine bipolare Spindel in vollständiger Zellteilung zu bilden. Die übrigen Zellen sind nicht in der Lage, eine bipolare Spindel zu erreichen und als Ergebnis mitosis durch eine multipolare Teilung zu beenden.
Unabhängig davon, ob die Spindel-Bipolarität erreicht wird, weisen Zellen mit zusätzlichen Zentrosomen eine signifikant erhöhte Mitosedauer im Vergleich zu Zellen mit zwei Zentrosomen auf. Hinweise darauf, dass die Dynamik der mitotischen Progression verändert werden kann, auch wenn Veränderungen im mitotischen Ergebnis nicht sichtbar sind. Bei der Definition der Expositionszeiten für Fluoreszenzkanäle können Sie die Belichtungszeiten optimieren, um die Phototoxizität zu begrenzen.
Auch Kamerapixelbinning kann ausgewählt werden, um niedrigere Belichtungszeiten zu ermöglichen. Dieses Verfahren hat Anwendungen in pharmakologischen Screenings, Invasions- und Migrationsanalysen. Diese Ansätze können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von medikamentösen Behandlungen oder die Dynamik der zellulären Beweglichkeit zu untersuchen.
