Diese Technik kann wichtige funktionelle Fragen über neuronale Reaktionen auf den Geschmack in den genikulären Ganglien beantworten, einem entscheidenden Teil des inneren Chorda-Tympani-Geschmackswegs. Diese Technik kann verwendet werden, um die Echtzeitreaktionen mehrerer einzelner Neuronen in einer einzigen experimentellen Studie zu überwachen, da die pro Tier aufgezeichneten Zellen signifikant höher sind als typischerweise mit der elektrophysiologischen Methode beobachtet. Mit der am Kopfpfosten montierten Maus in Rückenlage auf einem Heizkissen machen Sie einen zwei Zentimeter mittleren Schnitt in der Haut über dem Hals, vom Brustbein bis zum Kinn.
Und ziehen Sie die Haut und die Unterkieferdrüsen zurück, um die digastrischen Muskeln vollständig freizulegen. Nachdem Sie die Naht in der paratrachealen Muskulatur lokalisiert haben, trennen Sie die Naht mit stumpfer Dissektion und ziehen Sie das Gewebe zurück, um es zu öffnen. Schneiden Sie vorsichtig eine Öffnung in der Oberseite der Luftröhre, die groß genug ist, um ein Stück Polyethylenschlauch zu montieren, ohne mehr als die Hälfte des Durchmessers der Luftröhre zu schneiden, und führen Sie den Schlauch in die Luftröhre in Richtung Lunge ein.
Positionieren Sie die Retraktoren neu, um die paratracheale Muskulatur freizugeben und die Unterkieferdrüsen zurückzuziehen. Verwenden Sie dann eine kleine Menge Veterinärkleber, um die paratracheale Muskulatur über dem Schlauch zu versiegeln. Um die Paukenbulle aufzubrechen, necken Sie den gewünschten Digastrinnenmuskel vorsichtig nach oben und ziehen Sie das Bindegewebe auseinander.
Machen Sie einen Schnitt am vorderen Ende des Muskels und vermeiden Sie die Blutgefäße. Und ziehen Sie sich nach hinten zurück, bis die Paukenbulle frei ist. Neigen Sie den Kopf leicht nach hinten, um die Paukenbulle anzuheben, und lokalisieren Sie den Ast der Halsschlagader vor der hinteren Einstichstelle des Digastritoriumsmuskels.
Palpatieren Sie nur hinter diesem Blutgefäß für die konvexe Struktur der Paukenbulle und lokalisieren Sie eine Naht in der Muskulatur. Mit zwei Sätzen feiner Zangen an der Naht stumpf sezieren, bis der Knochen der Paukenbulla sichtbar ist, und verwenden Sie Retraktoren, um eine klare Sicht auf den Knochen zu behalten. Lokalisieren Sie die Naht, die vorne bis nach hinter auf der Bulla verläuft, und verwenden Sie eine chirurgische Sonde, um ein Loch in den Knochen in der Mitte der Naht zu stechen, dann verwenden Sie eine feine Endschere, um einen kreisförmigen Bereich im Knochen zu schneiden, wobei Sie darauf achten, die Blutgefäße nicht vor und hinter oder unter der Bulla zu schneiden.
Um das Genikulat freizulegen, lokalisieren Sie die Cochlea. Anterior zur Cochlea befindet sich der Tensor-Tympani-Muskel. Verwenden Sie eine Federschere, um diesen Muskel zu schneiden und zu entfernen.
Verwenden Sie die chirurgische Sonde, um ein Loch in das Cochlea-Vorgebirge zu stechen, und saugen Sie sofort an, um jede Flüssigkeit abzusaugen, die aus dem Loch fließt. Vergrößern Sie das Loch in der Cochlea und achten Sie darauf, das Blutgefäß, das die Cochlea umgibt, nicht am hinteren und seitlichen Rand zu beschädigen. Und neigen Sie den Kopf der Maus nach vorne, um das Loch im Schläfenbein unter der ehemaligen Cochlea-Struktur zu lokalisieren.
Beachten Sie den Grat vor dem Loch, das direkt über dem siebten Nerv sitzt. Und führen Sie eine chirurgische Sonde in das Loch ein, damit der Schläfenbein vorsichtig angehoben werden kann, um den siebten Nerv freizulegen. Wenn das Genikulat nicht vollständig sichtbar ist, neigen Sie den Kopf des Tieres vorsichtig nach hinten und versuchen Sie, den Knochen vor dem Nerv hochzuziehen.
Wenn die Ganglien noch verdeckt sind, ziehen Sie mehr Knochen von unten nach oben und achten Sie darauf, die Sonde nicht tief unter dem Knochen zu platzieren, da dies das Genikulat schädigen kann. Um das Tastant-Panel zu betreiben, verwenden Sie abgesaugt, um die Flüssigkeit über dem Genikulat zu entfernen und legen Sie die Maus auf ein saugfähiges Pad unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie das Loch in der Bulla, das Loch im Schläfenbein und den siebten Nerv, um das geniculate Ganglion zu lokalisieren.
Und verwenden Sie den FITCGFP-Filter auf dem epifluoreszierenden Zielfernrohr, um nach einzelnen GCaMP-exprimierenden genulären Ganglienneuronen zu suchen. Legen Sie die Dosiernadel für eine Tastant-Linie fest in den Mund des Tieres und legen Sie eine Petrischale unter den Mund, um Flüssigkeit aufzufangen. Synchronisieren Sie den Beginn der Videoaufzeichnung mit dem Beginn der präsentation und beobachten Sie den Live-Feed auf Antworten, Drift und Versickerung während der Aufnahme.
Wenn Versickerung auftritt, saugen Sie die Flüssigkeit ab, bis die Sicht auf das Genikulat klar ist, und versenden Sie das Tastant erneut. Wenn Drift auftritt, überprüfen Sie, ob alle Teile des Kopfpfostens fest angezogen sind. Wenn keine Reaktion auftritt, überprüfen Sie, ob die Flüssigkeit fließt und dass das Mikroskop und die Kamera auf die richtige Stelle fokussiert sind, ohne dass das Sichtfeld verdeckt wird.
Wenn alle gewünschten Experimente abgeschlossen sind, erleichtern Sie die Retraktoren vorsichtig und wiederholen Sie die Exposition und die Tastantanalyse auf der gegenüberliegenden Seite des Tieres. Wie beobachtet, sollten Geschmacksreize, die auf die Zunge angewendet werden, zu einem schnellen vorübergehenden Anstieg der GCaMP-Fluoreszenz führen, was zu einer spürbaren Helligkeitsänderung unter den reagierenden Neuronen führt. Die Analyse des Fluoreszenz-Videomaterials ermöglicht die Erzeugung von Spuren, die den Veränderungen der Fluoreszenz über die Baseline-Reaktion innerhalb einzelner interessierenden Regionen im Laufe der Zeit entsprechen.
Änderungen der Fluoreszenzintensität oberhalb des Schwellenwertes gelten als positive Reaktion. Neben der Schädigung der Ganglien ist es wichtig, Blutungen zu vermeiden. Wenn Blutungen auftreten, warten Sie, bis das Blut gerinnt, bevor Sie Kochsalzlösung und Absaugung auftragen, um das Blut aus dem Gesichtsfeld zu entfernen.
Die Visualisierung der Genikulatganglien hat es den Forschern ermöglicht, die Reaktionen von Neuronen auf geschmacksähnliche Reize direkt zu messen und diese Neuronen mit Werkzeugen wie Cre-abhängigem GCaMP zu identifizieren.
