Die Anzahl der Neuronen, die mit dieser Methode überwacht werden, ermöglicht die Erfassung von Neuronennetzwerkdaten, die mit älteren oder anderen Methoden nicht möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, fast 2.000 primäre sensorische Neuronen gleichzeitig zu überwachen und direkt auf Reize zu reagieren, die auf die Hinterpfote angewendet werden. Dieses Verfahren eignet sich besonders gut, um therapeutische Interventionen bei peripherer Allodynie und Schmerzüberempfindlichkeit zu untersuchen.
Diese Methode kann für die Untersuchung von Trigeminus- oder Genikulatganglien angepasst oder mit genetisch kodierten Sensoren für Spannungs- oder Zellsignalmoleküle, wie z. B. zyklisches AMP, verwendet werden. Es braucht Übung, um diese Operation durchzuführen. Sie können an bis zu sechs dorsalen Wurzelganglien an einem einzigen Tier üben.
Die Prozedur wird von mir selbst demonstriert, mit Unterstützung von John Shannonhouse und Mr. Ruben Gomez. Legen Sie die Maus zunächst auf ein beheiztes Pad, um die Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Lokalisieren Sie die Vergrößerung der Lendenwirbelsäule, indem Sie den Beckenknochen der Maus abtasten.
Rasieren Sie dann den Mausrücken über dem Bereich der Lendenvergrößerung. Machen Sie mit einer Schere einen dreiseitigen rechteckigen Schnitt über der Lendenwirbelvergrößerung und falten Sie die Haut mit einer Pinzette weg. Machen Sie mit der 13-Millimeter-Federdissektionsschere drei bis vier Millimeter Schnitte auf der rechten Seite der Wirbelsäule.
Verwenden Sie eine Schere, um die Haut und die Muskeln zu den Seiten zurückzuschneiden, um die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer Acht-Millimeter-Schere den Muskel und das Bindegewebe ab, um den Querfortsatz des rechtsseitigen L5-DRG zu reinigen. Versuchen Sie, Blutungen zu minimieren, indem Sie Baumwolle oder Gelschaum verwenden, um das Blut aufzunehmen.
Schneiden Sie den rechten L5-Querfortsatz mit Friedman-Pearson-Rongeuren oder einer starken feinen Pinzette auf und achten Sie darauf, das DRG nicht zu berühren. Bewegen Sie als Nächstes die Maus und das Heizkissen auf die benutzerdefinierte Bühne. Verwenden Sie Bühnenklebeband, um das Tier und das Heizkissen an Ort und Stelle zu befestigen.
Legen Sie die Nase des Tieres in den Nasenkegel für eine kontinuierliche Isofluran-Anästhesie. Fixieren Sie die rechte Hinterpfote, die aus einer Position außerhalb der Bühne herausragt, um die Reize leicht anwenden zu können. Fixieren Sie die Wirbelsäule mit den Tischklemmen über der Haut an den Wirbeln oder dem Beckenknochen direkt rostral und kaudal zum L5 DRG.
Stellen Sie die Klemmen und den Tisch so ein, dass die Oberfläche des DRG so eben wie möglich wird. Platzieren Sie dann den Tisch so unter dem Mikroskop, dass sich das Objektiv beim Absenken direkt acht Millimeter über dem DRG befindet. Setzen Sie das Rektalthermometer ein.
Schließen Sie die Stromleitungen an das Heizkissen und das Rektalthermometer an. Verbinden Sie den Nasenkonus mit den Isoflurangasleitungen. Verwenden Sie ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einem 10x 0,4 DIC-Objektiv und der zugehörigen Software für die Bildgebung.
Verwenden Sie die grünen FITC-Filtereinstellungen für Anregung bei 495 Nanometern, Emission bei 519 Nanometern und Detektionswellenlänge zwischen 500 und 580 Nanometern. Suchen Sie unter dem Mikroskop die Oberfläche des DRG. Stellen Sie die Klemmen auf dem Tisch so ein, dass die DRG-Oberfläche so eben wie möglich ist und die maximale Oberfläche in der Fokusebene visualisiert wird.
Überwachen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs, um die Isofluran-Anästhesie ohne Überdosierung aufrechtzuerhalten. Um das Mikroskop-Schnellscanning-Protokoll zu laden, verwenden Sie die typischen Einstellungen der Voxelgröße 2,496 x 2,496 x 16 Mikrometer, 512 x 512 Pixel, 10 optische Schichten Z-Stapel, eine Airy-Einheit für 32 Mikrometer, 1 % Laserleistung von 488 Nanometern und fünf Milliwatt, Pixelzeit 1,52 Mikrosekunden, Zeilenzeit 0,91 Millisekunden, Bildzeit 465 Millisekunden, LSM-Scangeschwindigkeit von acht, bidirektionale Abtastung, PMT-Detektorverstärkung 650 Volt und digitale Verstärkung von eins. Führen Sie einen kurzen Scan des DRG mit acht Zyklen durch, indem Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf "Experiment starten" klicken.
Erstellen Sie einen Film, indem Sie eine orthogonale Projektion von Scans mit einem Scan pro Frame im Zeitverlauf erstellen. Überprüfen Sie manuell die Bildschärfe und Bildartefakte, wie z. B. Helligkeitswellen, die das DRG durchqueren. Passen Sie die Klemmposition und die Dicke des optischen Schnitts an und wiederholen Sie diesen Schritt, bis ein klares, qualitativ hochwertiges Video erzielt wird.
Laden Sie dann das hochauflösende Scanprotokoll des Mikroskops mit den typischen Einstellungen der Voxelgröße 1,248 x 1,248 x 14 Mikrometer, 1024 x 1024 Pixel, Z-Stapel mit sechs optischen Schichten, 1,2 Airy-Einheit oder 39 Mikrometer, 5% Laserleistung von 488 Nanometern und 25 Milliwatt, Pixelzeit 2,06 Mikrosekunden, Zeilenzeit 4,95 Millisekunden, Bildzeit 5,06 Sekunden, LSM-Scangeschwindigkeit von sechs, bidirektionale Abtastung, PMT-Detektorverstärkung bei 650 Volt und digitale Verstärkung von eins. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten auf der Registerkarte Erfassung, um ein hochauflösendes Bild des DRG zu erstellen. Laden Sie das Schnellscanning-Protokoll des Mikroskops und zeichnen Sie die spontane Aktivität im DRG für 80 Zyklen auf.
Generieren Sie einen orthogonalen Projektionsfilm, und überprüfen Sie, ob das Bild eine ausreichende Qualität für die Analyse aufweist. Stellen Sie das Mikroskop für die Anwendung von Reizen auf 15 bis 20 Scans ein. Warten Sie, bis die Scans eins bis fünf abgeschlossen sind, um die Baseline zu erstellen.
Wenden Sie den Stimulus während der Scans sechs bis 10 an. Warten Sie nach jedem Stimulus mindestens fünf Minuten, bevor Sie den nächsten anwenden, um eine Desensibilisierung zu vermeiden. Halten Sie für eine mechanische Presse die Zange des Algometers mit der Pfote zwischen den Paddeln, ohne die Pfote zu berühren.
Kneifen Sie die Pfote zusammen, beginnend unmittelbar nach dem Ende des fünften Scans und stoppen Sie unmittelbar nach dem 10. Scan. Überwachen Sie die Presskraft mit einem Algometer und stellen Sie sicher, dass sie 10 g über der gewünschten Kraft nicht überschreitet. Für thermische Reize erhitzen Sie ein Becherglas Wasser auf knapp über die gewünschte Temperatur.
Wenn das Wasser die richtige Temperatur hat, wenden Sie den Stimulus sofort nach dem fünften Scan an, indem Sie die Pfote in das Wasser tauchen. Ziehen Sie das Becherglas sofort nach Scan 10 ab. Die chirurgische L5-DRG-Exposition mit anschließender konfokaler Mikroskopie ermöglichte es, bis zu 1.800 Neuronen gleichzeitig mit Pirt-GCaMP3-Mäusen abzubilden.
Primäre sensorische Neurone wurden in einem Ensemble auf Populationsebene für spontane Kalziumtransienten in Abwesenheit von Reizen und als Reaktion auf Reize in ihrem normalen physiologischen Kontext beobachtet. Starke Reize oder schädliche Hitze verstärkten die Kalziumreaktionen. Im Vergleich zum Pressen mit 100 g erhöhte das Pressen mit 300 g die Anzahl der Neuronen, die Kalziumtransienten produzieren, und den delta F durch F0-Bereich unter der Kurve.
Warme Wärme in einem nicht-schädlichen Temperaturbereich von 21 und 45 Grad Celsius erhöhte die Anzahl der Neuronen, die Kalzium-Transienten produzieren, und den delta F durch F0-Bereich unter der Kurve. Nicht-schädliche Temperaturen aktivierten eine geringere Anzahl von Neuronen, die Transienten produzierten, als ein schädlicher Wärmereiz bei 57 Grad Celsius. Darüber hinaus produzierten Neuronen mit kleinerem und mittlerem Durchmesser spontan und unter allen Reizen Kalziumtransienten, während Neuronen mit größerem Durchmesser Kalziumtransienten nur als Reaktion auf den 300-g-Pressreiz produzierten.
Das DRG sollte eben sein und eine optimale optische Schichtdicke aufweisen. Es sollte so sein, dass Sie die maximale Anzahl von Zellen erkennen können und es keine Welligkeit im Film gibt. Diese Technik wurde verwendet, um sensorische Modalitäten auf Populationsebene für Somatosensibilität und Geschmack zu analysieren und benachbarte Neuronen zu untersuchen, die paarweise oder in synchronisierten Clustern aktiviert werden und zu chronischen und neuropathischen Schmerzen beitragen.
