Dieses Protokoll ermöglicht es, die Funktionen von Geschmackszellen in einer natürlichen Mikroumgebung mit neuronalen Verbindungen und intakter Blutzirkulation zu beobachten. Mit dieser Technik kann die Zell-zu-Zell-Kommunikation in vivo untersucht werden. Füllen Sie zunächst die Reservoirs des unter Druck stehenden Durchflussperfusionssystems mit künstlichem Speichel und Geschmacksstoffen.
Schließen Sie die Druckluftleitung an den Reglereingang an und stellen Sie den Luftdruck im fluidischen Fördersystem auf 30 bis 50 Pfund pro Quadratzoll ein. Stellen Sie den Ausgangsdruck des Reglers auf 0,4 Pfund pro Quadratzoll ein und überprüfen Sie, ob Flüssigkeit aus dem Rohr ausströmt. Verbinden Sie den Verteiler von den Reservoirs mit dem Eingangsanschluss der Mikrozunge, verbinden Sie dann den Ausgangsanschluss der Mikrozunge mit einer Spritzenpumpe und ziehen Sie Flüssigkeit mit etwa 300 Mikrolitern pro Minute ab, um einen stationären Zustand herzustellen.
Vergewissern Sie sich, dass das Volumen des unter der Mikrozunge hängenden Tröpfchens konstant bleibt, und stellen Sie den Luftdruck und die Durchflussrate ein, um die gewünschte Probenhöhe zu erhalten. Sobald das mikrofluidische System eingerichtet ist, trennen Sie die Druckluftleitung und schalten Sie die Spritzenpumpe aus, bis die Maus für die In-vivo-Bildgebung vorbereitet ist. Nach der Verabreichung der Anästhesie an die Maus intravenös TRITC-Dextran über einen retroorbitalen Weg injizieren, um die Blutzirkulation während der Bildgebung zu beobachten.
Wenn die Maus in Rückenlage gebracht wird, sprühen Sie 70% Ethanol auf den Kopf. Verwenden Sie eine Zette, um die Kopfhaut leicht anzuheben, und verwenden Sie dann eine Schere, um etwa sieben Quadratmillimeter Haut abzusetzen. Nachdem Sie die Haare um die Kopfhaut gereinigt haben, entfernen Sie das Periost unter der Haut und tragen Sie einen sofortigen Klebstoff auf den Schädel auf.
Befestigen Sie dann den kundenspezifischen Kopffixierer. Sobald der Sofortkleber gehärtet ist, tragen Sie Zahnkleber um den Kopffixierer auf und erstarren Sie ihn durch Beleuchtung mit blauem Licht. Mit Sofortkleber die Unterlippe der Maus auf die untere Einheit der Mikrozunge kleben, dann die Maus auf die Mausvorbereitungsplatte legen und die Untereinheit an der Mikrozunge an den Haltepfosten befestigen, indem die Löcher am Rand der Mikrozunge mit den Pfosten ausgerichtet werden.
Ziehen Sie den Mauskopffixierer an der Kopffixiererhalterung an der Platine fest und passen Sie den Abstand zwischen dem Mauskopf und dem Gerät an. Drehen Sie dann mit dem Kopffixiererhalter den Mauskopf sanft um ca. 45 Grad. Nachdem Sie die Maus am Brett bewischt haben, verwenden Sie eine Kunststoffpinzette, um die Zunge sanft zu ziehen.
Befestigen Sie dann mit Sofortkleber die ventrale Seite der Zunge an der Oberseite der unteren Einheit der Mikrozunge. Um die Zunge feucht zu halten, wischen Sie die Oberfläche mit einem nassen Wattestäbchen ab und legen Sie dann ein in künstlichem Speichel getränktes Stück Gewebe auf die freiliegende Oberfläche der Zunge. Legen Sie die gekrümmten Unterlegscheiben auf die Pfosten, halten Sie den unteren Teil der Mikrozunge und bewegen Sie dann das Mauspräparat in den Mikroskopstadium.
Positionieren Sie die freiliegende Zunge der Maus unter der ungefähren Mitte des Objektivbereichs des Mikroskops, achten Sie darauf, nicht vom Dynamikbereich der Bühne abzuweichen, und ziehen Sie dann die Schrauben fest, um das Mausbrett fest auf der Bühne zu befestigen. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um ihre Körpertemperatur zwischen 36,5 und 37,5 Grad Celsius zu halten. Um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Luftröhre der Maus gelangt, legen Sie ein dünnes Stück verdrehtes Papier in den Mund der Maus, entfernen Sie dann das nasse Gewebe auf der Oberfläche der Zunge und legen Sie die vorbereitete Mikrozunge auf die Mauszunge, so dass die Oberfläche der Zunge durch das Bildfenster sichtbar ist.
Befestigen Sie die Mikrozunge, indem Sie beide Enden mit minimalem Druck vorsichtig verschrauben. Um mit der Aufnahme von Bildern zu beginnen, öffnen Sie die Mikroskopsoftware und schalten Sie dann den 920 Nanometer-Zwei-Photonen-Laser ein. Montieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv auf dem Mikroskop, senken Sie das Objektiv dann auf das Abbildungsfenster der Mikrozunge und tauchen Sie das Objektiv ein.
Beleuchten Sie im Kameramodus die Oberfläche der Zunge, indem Sie das blaue Licht einer Quecksilberlampe einschalten. Um die ungefähre Fokusebene zu finden, stellen Sie die Z-Achse ein und suchen Sie nach einem Autofluoreszenzsignal aus den filiformen Papillen. Suchen Sie dann mit dem X- und Y-Einstellknopf eine Geschmacksknospen.
Wechseln Sie in den Multiphotonenmodus und stellen Sie dann die Anregungswellenlänge, den Emissionsfiltersatz, den Scanmodus und die Rahmengröße für die Bildaufnahme ein. Mit der Geschmacksknospen in der Mitte des Bildgebungsfensters lokalisieren Sie die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, auf etwa zwei Dritteln der Höhe der Geschmacksknospen und visualisieren Die Durchblutung. Wenn der Blutfluss verstopft ist, lösen Sie die Befestigungsschrauben leicht, um den Blutfluss wieder aufzunehmen.
Stellen Sie die Z-Achse ein, um die Z-Ebene einer Geschmacksknospen zu finden, die eine ausreichende Anzahl von Geschmackszellen enthält, und fahren Sie dann 80 Sekunden lang mit der Kalziumbildgebung bei zwei bis sechs Hertz fort. Schalten Sie nach Beginn der Bildgebung das Reservoir des fluidischen Systems ein, um 20 Sekunden lang eine Geschmackslösung bereitzustellen. Nach 20 Sekunden Geschmacksstimulation schalten Sie das Reservoir wieder auf künstlichen Speichel um.
Warten Sie während der Bildgebung etwa drei bis vier Minuten zwischen den Sitzungen und liefern Sie konsequent künstlichen Speichel, um die Zunge feucht zu halten und das von der vorherigen Sitzung verbleibende Tastant wegzuwaschen. Die Zungenoberfläche der Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus ist mit autofluoreszierenden filiformen Papillen und spärlich verteilten Geschmacksknospen bedeckt. Die filiformen Papillen in Gelb werden mit einem Photodetektor bei 500 bis 550 Nanometern eingefangen und können von der Oberfläche der Zunge bis zu etwa 25 Mikrometer Tiefe beobachtet werden.
Die vom 500 bis 550 Nanometer Filter detektierten GCaMP-Signale in Grün und die tdTomato-Signale in Rot, die vom 607 bis 670 Nanometer Filter detektiert werden, repräsentieren die Geschmackszellen. Das tdTomato-Signal wird für die Analyse der Verhältnismetrik erhalten. Die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, werden mit dem 500 bis 550 Nanometer Filter im Kollagen-Bindegewebe erfasst, der die Geschmacksknospen strukturell unterstützt und mit dem 447 bis 460 Nanometer Filterset erfasst wird.
In diesem repräsentativen Beispiel des In-vivo-Geschmacksscreenings mittels Calcium-Bildgebung wird jede Geschmackszelle durch gestrichelte Linien abgegrenzt. In dieser Studie reagierte Zelle 2 sowohl auf süße als auch auf Umami-Tastants. Und Zelle 3 reagierte sowohl auf niedrige als auch auf hohe Salzschmessantien.
Keine der Zellen in dieser Geschmacksknospen reagierte auf saure Geschmäcker. Da der Zweck dieses Experiments darin besteht, die Zellfunktion des Geschmacks in der natürlichen Umgebung zu beobachten, ist es wichtig, die Fluoreszenzen beim Zubereitungsschritt in die Blutgefäße zu geben und ihre Zirkulation während des Experiments zu bestätigen.
