Minderwertige Oliven sind der ventralste Teil der Medulla und daher bei einem lebenden Tier extrem schwer zu erreichen. Hier führen wir ein Protokoll ein, um den erwachsenen Maushirnstamm von der ventralen Seite zu belichten, und verwenden GRIN-Linsen, um neuronale Aktivität in den minderwertigen Olivenneuronen aufzuzeichnen, die Kalziumsensoren exdrücken. Diese Methode vermeidet Schäden am lebenskritischen Hirnstamm und ermöglicht Untersuchungen zu räumlich-zeitlichen Aktivitätsmustern und Inputintegration in der minderwertigen Olive.
Da die Operation in der komplexen Halsregion mit vielen lebenswichtigen Strukturen durchgeführt wird, ist es wichtig, dass sie von einem Forscher mit hohen chirurgischen Fähigkeiten durchgeführt wird. Bereiten Sie ein Intubationsrohr vor, indem Sie einen 5 bis 6 Millimeter langen und 0,8 Millimeter breiten Schlitz von der Spitze eines 20-Spur-Katheters schneiden. Bereiten Sie eine stumpfe und gekrümmte Nadel vor, indem Sie die Spitze abschneiden, die Bruchfläche schleifen und mit der Zange biegen.
Dies wird verwendet, um eine Luftröhre während der Tracheotomie zu unterstützen. Verdünnen Sie 15 Milligramm pro Milliliter Ketamin mit Saline zu 15%Assemble operations tools and consumables. Stellen Sie das Heizkissen auf 38 Grad Celsius ein.
Drehen Sie den Nosecone 180 Grad horizontal in stereotaxic Rahmen. Wiegen Sie die Maus, deren minderwertige Olive zuvor von virustragenden GCaMP6s transfiziert wurde, und berechnen Sie die Menge an verdünntem Ketamin zur Injektion. Induktionsbox vorfüllen mit 5%isoflurane, und die Maus anästhesieren.
Montieren Sie die Maus in den stereotaxic Rahmen, ventrale Seite nach oben. Rasieren Maus Kehle und Oberschenkelbereich. Entfernen Sie das Resthaar mit Haarentfernungscreme.
Topisch Xylocain Gelee auf die Halshaut auftragen. Überwachen Sie die Maustemperatur mit einem rektalen Thermischen Sensor. Injizieren Sie einen Milliliter vorgewärmten saline intraperitoneally.
Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch starke Prise an den Hinterbauchzehen. Es sollte keine erkennbare Antwort ausgelöst werden. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Halshaut entlang der Mittellinie.
Trennen Sie die Nackenhaut von der eingeweideten Haut mit einer stumpfen Seziermethode und schneiden Sie die Haut ab. Freie Speicheldrüsen aus Bindegewebe, und kippen sie seitlich, um die Sternothyroid muskelbedeckte Luftröhre auszusetzen. Intraperitoneally injizieren die erste Dosis von verdünntem Ketamin bei fünf Milliliter pro Kilogramm Tiergewicht.
Sorgfältig gespalten Sternothyroid Muskel entlang der Mittellinie mit der Spitze einer feinen Zange, um Luftröhre auszusetzen. Luftröhre von Blutgefäßen und Speiseröhre mit Zangen mit stumpfer Seziermethode lösen. Injizieren Sie eine zweite Dosis verdünntes Ketamin mit 2,5 Milliliter pro Kilogramm Tiergewicht.
Kreuzweise eine stumpfe Nadel unter Luftröhre einsetzen. Heben Sie die Luftröhre mit der stumpfen Nadel an. Lassen Sie den Nahtfaden um den dritten Luftröhrenring gehen, kauden die Schilddrüse, mit einer Halbkreisnadel.
Machen Sie vier Instrumentenkrawatten auf diesem Ring. Pierce die Brusthaut mit der gleichen Halbkreisnadel und führen Sie den Faden durch die Haut. Heben Sie die Luftröhre vorsichtig mit dem Faden an und schneiden Sie die Luftröhre kaudal auf die Schilddrüse.
Ziehen Sie die Luftröhre in Richtung Brusthaut. Heben Sie die Öffnung der Luftröhre an, indem Sie ein kleines Stück chirurgischen Schwamm unter sich hinzufügen. Entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit in der Öffnungsspitze der Luftröhre mit einem dünnen Streifen Reinigungsgewebe.
Schalten Sie den Isofluran-Fluss von stereotaxic nosecone auf das Intubationsrohr. Setzen Sie das Intubationsrohr in die Luftröhre ein. Stellen Sie sicher, dass ein Teil des Schlitzes in der Röhre außerhalb der Luftröhre bleibt, um die Atmung zu ermöglichen.
Befestigen Sie die Luftröhre an der Brusthaut der Maus, indem Sie drei bis vier Instrumentenkrawatten herstellen. Binden Sie die Luftröhre mit dem Nahtgewinde, um das Intubationsrohr zu sichern. Schlitzen Sie den Sternothyroidmuskel entlang der Muskelfasern mit den feinen Zangen.
Schneiden Sie den isolierten Teil mit der Federschere ab. Sorgfältig freie Restluftundrache und Kehlkopf aus dem Muskel, um die Schäden an den Blutgefäßen im Muskel zu minimieren. Reste Luftröhre und Kehlkopf entfernen.
Freie Speiseröhre aus anhänglichen Geweben mit Zange und mit federheiner Schere abschneiden. Entfernen Sie den Längsmuskel, der den Hirnstamm und den ventralen Bogen des Atlas bedeckt. Entfernen Sie den Muskel, der den Atlas ventralen Bogen und die vordere Knolle bedeckt.
Schneiden Sie die ventralen Bögen des Atlas mit dem Rongeur. Entfernen Sie die vordere Knolle des Atlas. Entfernen Sie das Blut und die Flüssigkeit, um das Foramen magnum und den Hirnstamm zu sehen.
Erweitern Sie das Foramen magnum, indem Sie den okzipitalen Knochen mit dem Rongeur entfernen. Entfernen Sie den Knorpel, und schälen Sie vorsichtig die periosteale Schicht der Dura mater mit den feinen Zangen, um eine klare Sicht auf den ventralen Hirnstamm zu haben. Klemmen Sie den SpO2-Sensor am Oberschenkel der Maus, um Vitalzeichen wie Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung und Atemfrequenz zu überwachen.
Montieren Sie die GRIN-Linse am Implantationsstab. Reinigen Sie die Linse sorgfältig mit 70% ethanolgetränktem Reinigungsgewebe. Fixieren Sie den Implantationsstab auf stereotaxic Rahmen und montieren Sie das Miniaturmikroskop auf dem Implantationsstab.
Fügen Sie mehrere Tropfen Saline im Hirnstammbereich zum Eintauchen der GRIN-Linse hinzu. Nähern Sie sich dem Hirnstamm mit der GRIN-Linse. GCaMP6s, die minderwertige Olivenneuronen im oberflächlichen Bereich exdrücken, finden sich in einem rechteckförmigen Bereich, etwa 0,5 bis 1,7 Millimeter rostral zum verbleibenden Atlas und etwa 2,6 bis 1,1 Millimeter seitlich zur Mittellinie.
Schalten Sie die anregende blaue LED im Miniaturmikroskop ein, um GCaMP6s transfizierte minderwertige Olivenneuronen zu lokalisieren. Die Neuronen zeigen aufgrund verschiedener GCaMP6s-Expressionsniveaus unterschiedliche Ausgangsfluoreszenzintensität. Die Veränderung des Kalziumspiegels der eingekreisten unteren Olivenneuronsomata im Video auf der linken Seite zeigt uns Delta F geteilt durch F Spuren auf der rechten Seite.
Obwohl die Maus warm und hydratisiert gehalten wird, wird sie unweigerlich durch längere Anästhesie und Operation geschwächt. Es ist wichtig, die Dauer der Operation kurz zu halten, so dass die körperliche Verfassung der Maus gut für die Aufnahme sein wird. Ein erfahrener Forscher kann die Operation in 70 Minuten beenden.
Diese Methode, mit Modifikationen, kann verwendet werden, um andere benachbarte Regionen des ventralen Hirnstamms zu studieren.
