In diesem Protokoll können zwei Antikörper desselben Wirts zusammen im Immunfluoreszenz-Assay verwendet werden, um wirtszell- und pathogeninteraktionen zu untersuchen. Da es nur wenige kommerzielle Antikörper gibt, um spezifische Zellstrukturen und Proteine in Parasiten zu erkennen, kann dieses Protokoll sehr nützlich sein. Dies ist ein einfach durchzuführendes Doppelmarkierungs-Immunfluoreszenzprotokoll, das polyklonale und monoklonale Antikörper verwendet, die in derselben Spezies aufgezogen werden.
Viele Forscher sind sich vielleicht nicht bewusst, dass dies möglich ist. Dieser Ansatz hilft, wenn die Quelle der Antikörper begrenzt ist. Es kann verwendet werden, um die Erreger in den Wirtszellproteinen in infizierten Wirtszellen nachzuweisen und kann auch auf freie lebende Organismen angewendet werden.
Dies ist ein einfaches Protokoll, das einen Blockierungsschritt zwischen dem ersten und zweiten Antikörperpaar erfordert. Das Verfahren wird von Dr. Camila Gachet-Castro und dem Doktoranden Lays Trajano-Silva aus meinem Labor demonstriert. Sammeln Sie drei Tage nach der Infektion von LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi den Überstand aus den infizierten Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Zellkulturröhrchen.
Zentrifugieren Sie die Probe zu niedrigeren Zelltrümmern und platzieren Sie dann das Röhrchen bei Raumtemperatur, damit die Trypomastigoten zum Überstand schwimmen können. Sammeln Sie nach 10 Minuten den Überstand in einem neuen konischen Röhrchen, zentrifugieren Sie dann die Probe und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet, das die Parasiten enthält, in vollständigem RPMI-Medium wiederverwenden. Fügen Sie LLC-MK2-Zellen in 24-Well-Platten mit UV-sterilisierten abgerundeten Deckgläsern hinzu und lassen Sie the&m sich 16 Stunden lang niederlassen.
Um dann die Zellen zu infizieren, fügen Sie jedem Brunnen einen Überstand hinzu, der T.Cruzi enthält, und inkubieren Sie sechs Stunden lang. Als nächstes waschen Sie die Deckblätter, die die infizierten und nicht infizierten Zellen enthalten, fünfmal mit PBS und fixieren Sie dann die Zellen mit 2% Paraformaldehyd in PBS. Nach 10 Minuten die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen und dann die Deckgläser 10 Minuten lang mit nichtionischem Reinigungsmittel permeabilisieren.
Nach drei fünfminütigen PBS-Waschungen die Deckgläser in Blocklösung für 30 Minuten inkubieren, gefolgt von einer weiteren 30-minütigen Inkubation mit entweder einem monoklonalen oder polyklonalen Maus-Antikörper. Nach dem Waschen von PBS werden die Deckgläser 30 Minuten lang mit sekundären Antikörpern in Blocklösung und Phalloidin inkubiert, um Aktinfilamente in der Wirtszelle zu färben. Waschen Sie dann die Deckgläser noch einmal dreimal mit PBS, bevor Sie eine kleine Menge Anti-Fade-Montagereagenz mit DAPI-Medium auf die Oberfläche des Objektträgers auftragen.
Kippen Sie den Deckstab vorsichtig mit einer Pinzette im Medium, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Zur doppelten Markierung werden die Deckgläser nach dem Inkubieren der Deckgläser in Blocklösung, wie zuvor gezeigt, 30 Minuten lang im polyklonalen Antikörper der Maus inkubiert. Als nächstes waschen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS, bevor Sie sie 30 Minuten lang mit dem sekundären Antikörper inkubieren.
Führen Sie dann nach drei PBS-Wäschen einen zweiten Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG in Blockierlösung verdünnt durch. Nach 30 Minuten die Deckgläser erneut mit PBS waschen, bevor Sie sie mit dem monoklonalen Maus-Antikörper für weitere 30 Minuten inkubieren. Als nächstes, nach drei PBS-Waschungen, inkubieren Sie die Deckgläser mit Ziegen-Anti-Maus-IgG 2B-Antikörper und Phalloidin.
Tragen Sie dann nach drei PBS-Wäschen das Anti-Fade-Montagereagenz auf, wie zuvor gezeigt. Für die dreifache Markierung beginnen Sie nach dem Blockieren der Deckgläser und der Inkubation mit dem polyklonalen Antikörper der Maus, gefolgt von einem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper, eine neue Inkubation mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper in Blockierlösung für 30 Minuten. Dann, nach drei PBS-Wäschen, inkubieren Sie die Deckgläser mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper für 30 Minuten.
Als nächstes führen Sie nach drei PBS-Waschungen einen Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper durch, der in Blockierlösung für 30 Minuten verdünnt ist. Waschen Sie dann die Deckgläser erneut, bevor Sie 30 Minuten lang mit einem monoklonalen IgG-Subklassen-Antikörper der Maus inkubieren. Nach drei PBS-Wäschen die Deckgläser 30 Minuten lang mit einem bestimmten Paar Ziegen-Anti-Maus-IgG-Subklassen-Antikörpern inkubieren.
Nach der Inkubation die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS waschen. Analysieren Sie die immunfluoreszierenden Proben mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv und detektieren Sie die Fluoreszenz mit einem Photomultiplierrohr und einem Hybriddetektor. Erfassen Sie dann alle konfokalen Bilder mit getrennten Kanälen und führen Sie die Bildverarbeitung mit Adobe Photoshop durch.
Diese konfokalen Mikroskopiebilder zeigen Ergebnisse mit den Kontrollexperimenten von infizierten und nicht infizierten Zellen, die die Spezifität der Antikörper in der Wirtszelle und des internalisierten Parasiten hervorheben. Der polyklonale Antikörper anti-Trypanosoma cruzi FAZ der Maus erkannte das Riesenprotein T.cruzi in der Flagellum-Attachment-Zone am Parasiten flagellum, nicht aber in der Wirtszelle. Die Verteilung des heterogenen nukleären Ribonukleoproteins A1 in den Kernen wurde mit einem kommerziellen monoklonalen Mausantikörper beobachtet, der nur die Zellen des Wirtssäugetiers, nicht aber den Parasiten erkennt.
Auch die Wirts- und Parasitenkerne und die Parasitenkinetoplasten wurden mit DAPI gefärbt und Wirt F-Aktin wurde mit Phalloidin gefärbt, das mit Alexa 594 konjugiert war, was die Spezifität der Antikörper bestätigt. Double-Labeling Immunfluoreszenz zeigt die Proteinverteilungen im Wirt und den Parasiten, die durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Die Markierung deutete auf keine Kreuzreaktion zwischen Antikörpern mit dieser Methodik hin.
Zusammenfassend stellt das hier beschriebene Protokoll zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen eine grundlegende und ausgefeilte Technik dar, die an jede Kombination von Antikörpern angepasst werden kann. Dieser Ansatz macht die Immunfluoreszenz kostengünstig und kann helfen, die Lokalisation von zwei oder mehr Proteinen von Interesse zu untersuchen, wenn nur wenige Antikörper verfügbar sind.
