Diese Arbeit wurde vom Massachusetts General Hospital Department of Medicine Internal Funds (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering gewähren T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational and Integrative Biology Fonds für die Entwicklung und AI062773 unterstützt ( RJH), Zuschüsse AI062773, DK83756 und DK 043351 (RJX), NSF 0643745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) und National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Wir danken Nicholas C. Yoder für hilfreiche Diskussionen und Charles Filze (RPI, Inc.) für die technische Unterstützung.

1. Kultur Bedingungen von Krankheitserregern für optische Fallen <ol><li> Wachsen A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) auf einem semi-Agar-Medien mit SBD (Sabouraud Dextrose) bei 30 ° C für 3 Tage. </li><li> Wachsen C. albicans (SC5314) in YPD (Hefe-Pepton Dextrose) Flüssigkultur mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von Krankheitserregern für Fluoreszenzmarkierung <ol><li> Ernte gewünschten Betrag von Krankheitserregern und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Add 300 ul Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Reaktionsgefäß. </li><li> Mit Ultraschall-Gemisch für 30 Sekunden. </li><li> Zentrifugation bei 4000 rpm für 1 Minute. </li><li> Saugen Sie den Überstand, so dass Pellets ungestört. </li><li> Wiederholen (2,4) und (2,5) zwei weitere Male. </li><li> Resuspendieren in 500μL PBS. </li></ol> 3. Labeling von Krankheitserregern mit Fluoreszenzfarbstoff <ol><li> 1 mg des Farbstoffs von Interesse (zB Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 ul Dimethylformamid (DMF) (Konzentration von 10 mg / mL). </li><li> Add 3 ul der Farbstoffmischung zur Reaktion Röhrchen gewaschen Krankheitserreger. </li><li> Drehen oder Schütteln Probe bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wash Probe mit PBS 3X durch Zentrifugation bei 4000 rpm für 1 Minute. </li><li> Resuspendieren in 300 ul PBS. </li></ol> 4. Harvesting T-Zellen aus Vollblut <ol><li> Erhalten Vollblut (frisch). </li><li> Warmes Blut, PBS + 2% fötalem Rinderserum (FBS), und HISTOPAQUE auf Raumtemperatur. </li><li> Add RosetteSep menschlichen CD4 + T-Zell-Anreicherung Cocktail bei 50 ul / ml Vollblut. </li><li> Drehen Probe und Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnte Probe mit dem gleichen Volumen PBS + 2% FBS und vorsichtig mischen. </li><li> Schicht verdünnten Probe auf der HISTOPAQUE, Minimierung Mischen </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten bei 1200 xg bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. </li><li> Entfernen Sie die angereicherten Zellen. </li><li> Waschen Sie die angereicherten Zellen 2x mit PBS + 2% FBS Lösung. </li><li> Lyse roter Blutkörperchen für 2 Minuten mit der roten Blutkörperchen Lysepuffer </li><li> Fügen Sie 10 ml PBS + 2% FBS und Zentrifuge lysierten roten Blutzellen bei 1500 rpm für 5 Minuten </li><li> Saugen Sie den Überstand, Achten Sie darauf, das Pellet stören </li><li> Resuspendieren in IMDM Medien mit 10% fötalem Rinderserum </li></ol> 5. Vorbereitung von RAW 264.7 Makrophagen in die Kammer Dias <ol><li> Bereiten DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) bis 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin enthalten. </li><li> Warm Medien, Trypsin und PBS in warmes Bad auf 37 ° C. </li><li> Wash Platte 2x mit PBS </li><li> Absaugen PBS zwischen jedem Waschgang. </li><li> Add 5 ml Trypsin-to-Plate zu bedecken (für eine 10 cm Zellkultur-Platte). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Vorsichtig klopfte Seite der Platte, um Zellen von der Platte ablösen. Achten Sie darauf, Trypsin außerhalb der Platte spritzen. </li><li> Add 5 ml oder eine äquivalente Menge von Medien, um Trypsin. </li><li> Saugen Sie Mischung in ein Reaktionsrohr. </li><li> Zentrifugation bei 1000 xg für 3 Minuten. </li><li> Absaugen Medien Achten Sie darauf, das Pellet stören. </li><li> Resuspendieren in 10 mL von Medien. </li><li> Add 400 ul Medien zu jeder Kammer der Kammer schieben. </li><li> Add 5 ul Zellsuspension zu jeder Kammer. </li><li> Wachsen Sie über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 6. Addition von Krankheitserregern zu Probe <ol><li> Pipet 5-10 ul der markierten Krankheitserreger von Interesse (aus den Schritten 1-3) in die Kammer. </li><li> Gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter, vorsichtig auf den Boden der Kammer berühren, die eingehalten Makrophagen zu stören. </li></ol> 7. Loading Probe auf Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop (in Video-, Komponenten durch Scan) <ol><li> Schalten Sie alle Komponenten, um sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. </li><li> Align-Mikroskop für DIC Imaging. </li><li> Entfernen Kammer Folie aus Inkubator. </li><li> Legen Kammer gleiten in spezialisierten Bühne. </li><li> Entfernen Sie die obere Kammer des Schlittens (notwendig für DIC Imaging). </li></ol> 8. Vorbereitung für optische Fallen (in Video-, Komponenten-Scan durch und wie es in Mikroskop integriert) <ol><li> Schalten Sie Auslöser für die optische Falle. </li><li> Schalten Sie IR-Laser. </li><li> Offene Blende (am Laser) zur optischen Falle. </li><li> Bestätigen Blende vor IR-Laser wird durch die Überprüfung mit IR-Karte geschlossen. </li></ol> 9. Auswahl und Manipulation der Erreger mit optischen Falle <ol><li> Konzentrieren Sie sich auf Makrophagen auf Einhaltung gleiten. </li><li> Suche Krankheitserreger frei schwankenden in Lösung neben Makrophagen. </li><li> Bewegen der Bühne, so dass der Erreger in der Nähe der Falle ist. </li><li> Offene Blende und greifen in die Falle. </li><li> Bewegen Probe Makrophagen in Kontakt zu bringen mit der stationären Falleped Erregers. </li><li> Bild mit Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop, entweder in DIC, Fluoreszenz oder Kombination aus beidem. Typischerweise ist das Fallenstellen in DIC getan, und Echtzeit-Bildgebung mit Fluoreszenz getan. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse: Zur Ausübung volle räumliche und zeitliche Kontrolle von Krankheitserregern und Perlen in einem in vivo und in vitro-Umgebung haben wir eine custom-built Trapping Apparat auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop (schematisch in Abb.. 1) integriert. Bei voller Stärke, vorausgesetzt, der Laser 350 mW Leistung und nach der Kopplung des Lichts mit den verschiedenen optischen Komponenten in der optischen Falle Apparat, ~ 80 mW Leistung bei der TIRF Ziel, als mit einem Leistungsmesser gemessen wurde, wurde verwendet, um die Falle zu bilden in der Kammer. Um ein Objekt in der Kammer in Bezug auf die eingeschlossene Objekt zu positionieren, war die Bühne bewegt, während das eingeschlossene Objekt stationär mit der Trapping-Laser. Die Bühne war langsam genug Geschwindigkeiten bewegt, so dass die Zugkraft auf die eingeschlossene Partikel nicht über die maximale Klemmkraft. Separate Populationen von C. albicans (typische Größe - ~ 5 um) wurden mit jeweils drei Farben (AF488, AF568, AF647 und, entsprechend grün, blau und rot in der Abbildung bezeichnet) versehen, die Bildgebung mit Mehrfach-Fluoreszenz-Kanäle zeigen gleichzeitig optisch Trapping des Erregers. Ein einziger C. albicans wurde gefangen und in einem quadratischen Muster durch ein Cluster von anderen Hefe bewegt, wie durch graue Pfeile angezeigt, was die Fähigkeit zur Erfassung und Manipulation der spezifischen Lage eines einzigen Erreger durch den Betreiber selbst in einem überfüllten Umgebung gewählt (Abb. 2A) . Um zu veranschaulichen weiter die Flexibilität dieses Systems, die unterschiedliche Form Morphologien durch pathogene Organismen ausgestellt Falle wurde die optische Pinzette auch in der Lage zu halten und zu situieren ein C. albicans Partikel mit einem Pseudohyphen. Die C. albicans mit AF647 (rot) markiert war, wurde auf einer Bahn bewegt, wie durch den weißen Pfeil dargestellt und stellte neben fluoreszierende GFP-LC3-RAW-Zellen (Abb. 2B). Die Hefe Teil der C. albicans war gefangen wie die Pseudohyphen gezogene entlang. Wir haben auch Aspergillus fumigatus neben einem RAW-Maus Makrophagenzelllinie, um die absolute Zeitrahmen der Phagozytose mit dieser speziellen Zell-Linie und Pathogen (Abb. 3A) analysieren positioniert. Sobald der Erreger in Kontakt mit der Zelle, ist die Falle abgeschaltet und Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um die anschließende zelluläre Ereignisse zu beobachten (Abb. 3B). Die optische Falle wurde auch verwendet, um primäre T-Zellen zu erfassen isoliert aus dem Blut und den angrenzenden gerichtet, um die Kügelchen mit anti-CD3-Antikörper, um für die T-Zell-beschichtet, um einer immunologischen Synapse mit dem Wulst (Abb. 4) bilden, zeigen die zusätzlichen Vielseitigkeit direkt abzufangen und zu manipulieren Immunzellen. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Übersicht und Schema der kombinierten optischen Falle und Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop Setup. Instrument Layout zeigt die Trapping-Strahl (violett), Beleuchtungsweg für Hellfeld-Tomographie (orange), Fluoreszenz-Anregungs-(rot), Fluoreszenz-Emission (grün), charge-coupled device (CCD)-Kamera, Elektron-Multiplikation charge coupled device (EM- CCD-Kamera), dichroitische Spiegel (D1 und D2), Spiegel (M1 und M2) und Linsen (L1, L2, L3, L4). Alle anderen Komponenten des trap-konfokalen Mikroskop-System sind in der Abbildung gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. (A) Fluoreszenz-Bilder von gefangenen und manipuliert C. albicans. A gefangen fluoreszenzmarkierten (Alexa Fluor 488 (AF488), blau) Organismus in einem Feld von anderen fluoreszenzmarkierten C. albicans (AF568, Grün und AF647, rot). Die Bühne ist rund um die gefangen, blau CA Teilchen als durch die grauen Pfeile bewegt werden. (B) Trapped pseudo-Hyphenform von C. albicans neben GFP-LC3 RAW Zelle. Fluoreszenzmarkierten psuedohyphal Form von CA (rot, AF647) optisch gefangen und zog neben GFP-LC3 ausgedrückt RAW Makrophagen. Die CA Organismus ist entlang der Bahn bewegt, wie durch den weißen Pfeil gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Trapping und Positionierung von A. fumigatus neben einem phagocytic RAW Zelle. (A) Hellfeld Bilder der gefangenen A. fumigatus, als durch den weißen Pfeil angedeutet, bewegt und auf dem Weg durch den roten Pfeil angedeutet positioniert. Die eingeschlossenen Erreger ist leicht unscharf aus, um die Falle schieben den Organismus leicht oberhalb der Fokusebene. A. fumigatus bewegt wird, bis es neben platziert ist, um die gewünschte RAW-Zelle. (B) Fluorescence Bildgebung von Phagozytose von A. fumigatus von RAW-Zelle. Nach der eingeschlossenen Erreger neben einem RAW-Zelle gelegt wird, ist die Phagozytose-Prozess aktiviert. Mit 30 s, beginnt die Membran des RAW-Zelle zu verändern und bilden eine Tasse um das Teilchen. Bei 60 s, ist der Kelch voll ausgebildet. Von 90 auf 150s, die A. fumigatus ist verschlungen und von 180 s, die Partikel vollständig internalisiert <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Trapping primären T-Zelle zu Synapse mit anti-CD3 beschichteten Beads zu bilden. DIC Bilder eines primären T-Zellen durch das optische Falle in eine Position neben einem Wulst beschichtet mit anti-CD3-Antikörper verschoben. Die Zelle bildet dann einer immunologischen Synapse, die nicht leicht zu erkennen in den Bildern.

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In dieser Arbeit verwenden wir einen optischen Falle auf Krankheitserreger mit Abmessungen zwischen 3 um einzufangen - 5 pm. Obwohl Krankheitserreger von Interesse für unser Labor in der Regel diese Dimensionen haben, ist die optische Pinzette hier beschriebene System flexibel auf eine Vielzahl von Größen Falle. In der Tat optische Fallen wurden verwendet, um Partikel von einzelnen Atomen, Zellen etwa 10 um im Durchmesser erfassen. Zusätzlich wurde diese optische Fallen System in der Lage, Partikel in verschiedenen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Albino-Stamm, B-5233/RGD12-8, Geschenk von KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B-Mutante, Geschenk von Eleftherios Mylonakis, MGH, SC5314-Stamm, Geschenk von Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> ± 20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Frisches Blut </td><td></td><td></td><td> Gift aus RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon inversen Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modell Ti-E </td></tr><tr><td> Trapping-Laser, ChromaLase </td><td> Blue Sky Research </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Anregungs-Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td> Modell Innova 70C </td></tr><tr><td> Breadboards zum Einfangen von Komponenten </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Optische Lufttisch </td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronischer Verschluss mit Pedal </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Gekauft von Vincent Associates, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Singlemode Glasfaser </td><td> Oz Optics </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Stellungsregler </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Faserkollimator </td><td> Oz Optics </td><td> HPUCO-23 bis 1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Objektive für Teleskop </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Brennweite von 150 mm </td></tr><tr><td> Übersetzung Stufen (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroitischen Spiegel </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2P8 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, Öl-Immersion, TIRF Ziel </td></tr><tr><td> Konfokale Kopf </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizer </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston-Prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Filterrad </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Filterrad </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered Deckglas </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Beschichtet mit anti-CD3 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Dynamische Live Cell Imaging ermöglicht die direkte Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen zwischen den Zellen des Immunsystems 1, 2, aber der Mangel an räumlicher und zeitlicher Steuerung zwischen den Fresszellen und Mikroben geleistet hat Beobachtungen in den ersten Interaktionen von Wirt Reaktion auf Krankheitserreger konzentrieren schwierig. Historisch gesehen haben interzellulären Kontakt Veranstaltungen wie Phagozytose 3 durch Mischen von zwei Zelltypen abgebildet worden, und dann kontinuierlich Scannen der field-of-view, um serendipitous interzellulären Kontakte auf der entsprechenden Stufe der Interaktion zu finden. Die stochastische Natur dieser Ereignisse macht dieses Verfahren langwierig, und es ist schwer zu früh oder flüchtige Ereignisse in Zell-Zell-Kontakt durch diesen Ansatz zu beobachten. Diese Methode erfordert finden Zellpaaren, dass am Rande der Kontakt sind, und beobachtet sie, bis sie vollendet ihre Kontaktdaten, oder nicht. Um diese Einschränkungen nutzen wir optische Fallen als nicht-invasive, nicht-destruktive, sondern eine schnelle und effektive Methode, um Zellen in Kultur positionieren. Optische Fallen oder optische Pinzette, sind zunehmend in der biologischen Forschung eingesetzt, um zu erfassen und physisch zu manipulieren Zellen und anderen Mikrometergröße Teilchen in drei Dimensionen 4. Strahlungsdruck wurde zum ersten Mal beobachtet und auf optische Pinzette-Systeme in 1970 5, 6, und wurde zum ersten Mal verwendet werden, um biologische Proben im Jahr 1987 7 zu steuern. Seither haben optische Pinzette in eine Technologie ausgereift, um eine Vielzahl biologischer Phänomene 8-13 Sonde. Wir beschreiben eine Methode, 14, die Fortschritte Live Cell Imaging durch die Integration einer optischen Falle mit Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf exquisite räumliche und zeitliche Steuerung von pathogenen Organismen in einer physiologischen Umgebung bieten, um Wechselwirkungen mit Wirtszellen, wie die ermittelten erleichtern Betreiber. Live, wurden pathogene Organismen wie Candida albicans und Aspergillus fumigatus, die tödlich enden, invasive Infektionen bei immungeschwächten Personen 15, 16 (z. B. AIDS, Chemotherapie und Organtransplantation Patienten) kann dazu führen, optisch gefangen mit zerstörungsfreien Laserintensitäten und zog neben Makrophagen, die den Erreger phagozytieren können. Hohe Auflösung, Durchlicht und Fluoreszenz-basierten Filmen etabliert die Fähigkeit zur frühen Ereignisse der Phagozytose in lebenden Zellen zu beobachten. Zur Demonstration der breiten Anwendbarkeit in der Immunologie, wurden primäre T-Zellen auch gefangen und manipuliert werden, um Synapsen mit anti-CD3 beschichteten Mikrokügelchen in vivo bilden und Zeitraffer-Bildgebung der Synapsenbildung wurde ebenfalls erhalten. Durch die Bereitstellung einer Methode, um feine räumliche Steuerung von Live-Erreger in Bezug auf Immunzellen ausüben können zelluläre Interaktionen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit minimaler Störung von Zellen aufgenommen werden und können leistungsfähige Einblick in frühen Reaktionen der angeborenen und erworbenen Immunität zu erhalten.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Serie: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Herstellung optischer Qualität Glasflächen, Makrophagen Fusion zu studieren

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...