Wir möchten Patrick Hayden (MatTek) für hilfreiche Diskussionen danken, und Robert Smith und Libby Perry of Georgia Health Sciences University für ihre EM Fähigkeiten. Diese Studie wurde von NIDCD gewähren DC010187 zu DAD finanziert

1. Vorbereiten des Biosicherheitswerkbank für die EpiAirway Gewebe <ol><li> Das Tragen eines speziellen Laborkittel, mit Haar zurück und Handschuhen verbunden, starten Sie den laminaren Strömung. Nach 5 Minuten, verschieben Sie alle Werkzeuge im Schrank (Pipetten, Spitzen, Reaktionsgefäße usw.) auf der einen Seite, sprühen die Biosicherheit Schrankinneren und Flügel mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberen Papiertüchern. Spray die gereinigte Innenraum wieder mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Bewegen Sie die Werkzeuge, um auf der sauberen Seite und wiederholen Sie den Vorgang Ethanol. </li><li> Verwenden Sie Aerosolbarriere Pipettenspitzen und engagierten Pipetten in den Schrank. Zur Verwendung einzeln verpackte sterile serologische Pipetten, vorbei am gesteckt Ende durch den laminaren Strömung, aufzubrechen, und schieben Sie die Pipette in das Kabinett, das Verwerfen der Verpackung außen. </li><li> Die EpiAirway Beilagen müssen mit einer sterilen Pinzette gehandhabt werden. Legen Sie 6-Zoll-Fein-Spitze gebogenen Pinzette in selbstdichtend Sterilisation Beutel und Autoklaven. Bereiten Sie genug, um mindestens sechs pro Tag einsatzbereit. </li></ol> 2. Auspacken des EpiAirway Gewebe <ol><li> Sprühen Sie die Arbeitsfläche in der Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberem Küchenpapier. Spray wieder und lassen die Oberfläche zu trocknen, bevor zu verwenden. Öffnen Sie die EpiAirway Feld und entsorgen Sie die Styropor und Verpackungsmaterial. </li><li> Die EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung, AIR-100-MM ABF (MM), sind Eigentum von MatTek und ist im Kit mit den Einsätzen geschickt. In der Biosicherheitswerkbank, label sechs sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen mit den Medientyp und Datum, und lösen Sie die Kappen. Sprühen Sie die Medien-Flasche mit 70% Ethanol und öffnen im Schrank. Aliquot 25 ml MM in jedes Röhrchen mit einer neuen sterilen serologischen Pipette für jedes Rohr, ziehen Sie die Kappen, und lagern bei 4 ° C. Verwenden Sie ein frisches Aliquot MM jeden Tag. </li><li> Wiederholen Sie Punkt 2.2 mit einer frischen Flasche 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) mit Kalzium und Magnesium. Wiederholen Sie den Vorgang mit D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Speichern Sie alle Aliquots bei 4 ° C. </li><li> Die EpiAirway Einsätze AIR-100 kommen in einem 24-Well-Platte bei 4 ° C auf festen Medien-haltige Agarose, und muss in 6-well Platten für den Einsatz gebracht werden. Beschriften Sie jede Platte mit dem Datum und Beschreibung mit einem Ethanol-resistente Marker. Platz 1 Milliliter 4 ° C EpiAirway MM in jedes Well. Entfernen Sie die Transportsicherung Platte aus der Verpackung, Spray mit 70% Ethanol, und in der Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie das Klebeband und öffnen Sie die Platte. Mit autoklaviert Zange, entfernen Sie die feuchten Gaze über die EpiAirway Einsätze. </li><li> Pick-up ein Insert mit autoklaviertem Pinzette mit einer Drehbewegung in die Freigabe aus dem Agarose-Hilfe, und in einen Napf einer 6-Well-Platte. Einige Agarose kann, um den Einsatz halten, zumal die Temperatur der Transportplatte auf Umgebungstemperatur steigt. Verwenden Sie eine sterile Wattestäbchen, um vorsichtig die Agarose aus dem Einsatz. Berühren Sie nicht die Membran, und überprüfen, dass keine Luftblasen unter der Einsätze sind gefangen. Legen Sie die Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Lassen Sie mindestens 24 Stunden für die Gewebe in den Inkubator vor dem Start Co-Kulturen ausgleichen. </li></ol> 3. Wartung von EpiAirway Gewebe <ol><li> Mit autoklaviert Zange holen ein Insert und sanft Pipette 200 Mikroliter vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium auf das Gewebe und Rock des Einsatzes. Kippen Sie das Insert in einem Winkel und platzieren Sie Ihre sterile P1000 Pipettenspitze gegen die Kunststoff-Ring, dass die Membran an der Unterseite des Einsatzes hält. Berühren Sie nicht das Gewebe. Saugen Sie das D-PBS spülen und in einen markierten sterile Kryoröhrchen. Die Proben können bei -20 ° C eingefroren und untersucht für Mucin und / oder Zytokin-Expression zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Ändern Sie den basalen MM täglich durch Absaugen und Austauschen mit 1 Milliliter frisches MM. Verwenden Sie eine neue Barriere Pipettenspitze für jedes Well. Behandeln Sie die verwendeten Medien mit 10% Bleiche Nacht und entsorgen. </li></ol> 4. Inokulation von EpiAirway Gewebe <ol><li> Streak eine frische Kultur nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) aus gefrorenen Glycerin Lager auf Schokolade-Agar. Wachsen Sie über Nacht in einer feuchten 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag, resuspendieren einzelne Kolonien von NTHi in vorgewärmten D-PBS mit Kalzium und Magnesium zu einer OD (600 nm) von ca. 0,7. Vortex kräftig vor der Messung der optischen Dichte. Das Verhältnis der optischen Dichte auf Kolonie-bildenden Einheiten pro ml (KBE / ml) von NTHi ist, dass eine OD (600 nm) von 0,2 entspricht in etwa 1,0 x 10 8 CFU / ml. Daher ist eine OD (600 nm) von 0,7 etwa 3,5 x 10 8 CFU / ml. Dieser Algorithmus sollte für jeden NTHi Belastung vor der Impfung überprüft werden. </li><li> Die EpiAirway Gewebe AIR-100 sind auf Einsätze mit einer Fläche von 0,6 cm 2 und eine 0,4 Mikron Membran gewachsen. Die Gewebe werden von ~ 8,0 x 10 5 bis ~ 1,0 x 10 6 komponiert &lt;/ Sup&gt;-Zellen. Daher entspricht eine Impfung von 1,0 x 10 7 CFU zu einer Multiplizität der Infektion von etwa 10 bis 12. Um zu impfen, spülen jedes EpiAirway einfügen wie in 3.1, dann fügen Sie 28 Mikroliter der Bakteriensuspension in 4,2 bis der apikalen Oberfläche von jedem EpiAirway Einsatz im Biosicherheitswerkbank vorbereitet. Nicht impfen die basale MM. Return jede Platte in den Inkubator. </li></ol> 5. Die Quantifizierung der NTHi Inokulum <ol><li> Bereiten Sie eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Lösung mit 0,1% Gelatine (PBS-G), Autoklaven zu sterilisieren. Label sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit der gewünschten 1:10 Verdünnungen auf der OD (600 nm) des Inokulums und aliquoten 900 Mikroliter der sterile PBS-G in jedes Röhrchen basiert. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um den geimpften NTHi aufzuzählen. Legen Sie diese Platten in einem Luft-Inkubator auf den Kopf mit der Unterseite der Platte ruht auf der Hälfte der oben für eine Stunde. Damit wird die Platte sowohl warm bis 37 ° C und die Oberfläche zu trocknen, die Erleichterung der Drop-Beschichtung von NTHi. </li><li> Starten Sie das serielle 1:10 Verdünnungen des Inokulums durch Zugabe von 100 Mikroliter der Bakteriensuspension von 4,2 auf der ersten Röhre. Vortex jeder Verdünnung kräftig für 5 Sekunden bevor die nächste. Drop 10 Mikroliter Aliquots auf den vorgewärmten und Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten, mit der Hälfte der Platte für jede Verdünnung. Fünf bis sechs 10 Mikroliter Aliquots können auf einer Hälfte eines jeden 100 mm Platte ohne fließendes zusammen passen. Wenn trocken, statt den Kopf in einer befeuchteten 37 ° C CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag bestimmen die CFU / ml durch Zählen der Verdünnungen, 15-30 verschiedene Kolonien in jedem Tropfen haben und die Berechnung zurück an Ihren aktuellen lebensfähig Inokulum von NTHi. </li></ol> 6. Langfristige Co-Kultur mit NTHi <ol><li> Alle 24 Stunden, waschen Sie die Einsätze wie in 3.1, dann ist die Waschungen jedes Gewebe, das mit dem gleichen Stamm von Bakterien und bei -20 ° C in einer markierten Kryoröhrchen für zukünftige Analysen wurden geimpft Pool. Diese Proben können auf das Vorhandensein von Mucin durch Dot-Blots oder für die Expression von Zytokinen mittels ELISA getestet werden. Alternativ kann Gewebe für mRNA geerntet werden und qPCR können auf Gene von Interesse durchgeführt werden. Ändern Sie den basalen MM täglich in 3,2. Fahren Sie für die Dauer der Co-Kultur. </li></ol> 7. Die Ernte der EpiAirway Gewebe <ol><li> Bereiten Sie eine frische 1% ige Lösung von Saponin in D-PBS ohne Calcium und Magnesium-, Filter-sterilisiert und warm bis 37 ° C. </li><li> Warm eine 50 ml Tube MM und anderen von D-PBS ohne Calcium und Magnesium zu 37 ° C. </li><li> Bereiten Verdünnungsröhrchen wie in 5.1, sowie eine leere sterile 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pro Platte, mit der Nummer und NTHi Belastung gekennzeichnet. </li><li> Die EpiAirways kann entweder für insgesamt Zell-assoziierten Bakterien geerntet werden, die sowohl Anhänger und verinnerlicht Organismen oder für internalisierte Bakterien nur. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Schokolade-Agar-Platten benötigt, um Drop-Platte der Zell-assoziierten oder überfallen NTHi, Etiketten und trocken für eine Stunde in einer Luft-Inkubator wie in 5.2. </li><li> Zur Ernte insgesamt Zell-assoziierten Bakterien, spülen Sie die apikale Oberfläche der EpiAirways dreimal mit 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium, dann kippen Sie das Insert und spülen Sie alle verbleibenden MM von der Basalmembran. Die erste Wäsche kann für eine spätere Analyse eingefroren werden; entsorgen Sie die folgenden Wäschen. </li><li> Legen Sie die gewaschenen einfügen in eine neue 6-well-Platte ohne MM und Pipette 250 Mikroliter der sterile 1% Saponin-Lösung von 7,1 auf der apikalen Oberfläche der einzelnen Gewebe. Zurück zu den Inkubator für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie aus dem Inkubator und mit einem sterilen P1000 Pipettenspitze, schrubben die Gewebe von der Membran mit einem Hin-und Herbewegung, durch eine kreisförmige Bewegung, um das Gewebe an den Rändern des Einsatzes zu entfernen. Mit einer großen Bohrung sterile P1000 Pipettenspitze, legen Sie die Suspension in die leere beschriftet Rohr in 7,3 zubereitet. Eintragen von 250 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium auf der apikalen Oberfläche der Einlage. </li><li> Untersuchen Sie die CD mit einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob es eine verbleibende Gewebe geerntet werden. Wenn nötig, wieder schrubben mit einem anderen sterilen P1000 Pipettenspitze, dann fügen Sie diese Suspension auf das Rohr von 7,8 mit einer großkalibrigen sterile P1000 Pipettenspitze. Bringen Sie das Gesamtvolumen des Rohres zu 1 Milliliter mit D-PBS ohne Calcium oder Magnesium. </li><li> Kräftig Wirbel der Zellsuspension bei Höchstgeschwindigkeit für 1 Minute. Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet, saugen die Suspension in der Spritze durch die Nadel. Langsam gehen die Suspension durch die Nadel 3-mal, dabei nicht zu Blasen zu erzeugen. Vortex kräftig wieder für 1 Minute. </li><li> Mit einer großen Bohrung Pipettenspitze, Platz 100 Mikroliter der Suspension in den ersten Verdünnungsröhrchen in 7 vorbereitet.3. Vortex kräftig für fünf Sekunden, dann machen serielle 1:10 Verdünnungen. Drop-Platte den gewünschten Verdünnungen auf die Oberfläche getrocknet Schokolade-Agar-Platten. </li><li> Zur Ernte verinnerlicht Bakterien nur, waschen jeden Einsatz 3 mal mit je 200 Mikroliter D-PBS ohne Calcium oder Magnesium. Bewahren und frieren die ersten Waschgang. Add Gentamicinsulfat auf vorgewärmten MM, um eine endgültige Konzentration von 100 Mikrogramm / ml. Bereiten Sie 1,5 ml Medium pro Platte geerntet werden. Ersetzen Sie die basale MM mit der Gentamicin-haltigen MM, und 300 Mikroliter Gentamicin-haltigen MM auf der apikalen Oberfläche. Legen Sie die Platte wieder in die CO 2-Inkubator für eine Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Gentamicin-haltigen MM aus der apikalen Oberfläche und waschen die apikale Oberfläche und Basalmembran des Einsatzes ausführlich mit vorgewärmten D-PBS ohne Calcium und Magnesium. Gehen Sie wie in 7,7-7,11. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (A.) nicht infizierten EpiAirway Gewebe und (B) Gewebe nach einer 5-Tage-Co-Kultur mit NTHi sind in Abbildung 1 dargestellt. Langfristige Co-Kultur mit NTHi nicht zu erheblichen Schäden an der apikalen Ergebnis Gewebe, unterstreicht den Nutzen der EpiAirway Modell. Eine graphische Darstellung, die Zahl der internalisierten Bakterien im Laufe der Zeit im Gewebe quantifiziert wird in Abbildung 2 dargestellt. Beide Ergebnisse sind recht reproduzierbar, so dass die EpiAirway Gewebe eine konsistente und biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege in die Studie NTHi Wirt-Pathogen- Wechselwirkungen. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie EpiAirway Gewebe. A. infizierte Kontroll-Gewebe. B. Tissue nach fünf Tagen der Co-Kultur mit NTHi. Keine signifikanten Schäden an der apikalen Oberfläche ist in den infizierten Geweben beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Anzahl der NTHi verinnerlicht im Laufe der Zeit während EpiAirway Co-Kultur. Der Stamm R2866 wurde auf etwa 1,0 x 10 7 CFU / insert (Tag 0), dann für verinnerlicht Bakterien bei jedem angegebenen Zeitpunkt geerntet geimpft. Bars repräsentieren n = 3 Wiederholungen in mindestens verdoppeln. Fehlerbalken sind SD.

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Methode erlaubt die Untersuchung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem biologisch relevanten Hintergrund von primären humanen respiratorischen Gewebe an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Hier haben wir NTHi als der Erreger verwendet, sondern das Zusammenspiel von Bakterien, die nicht vorstellen unannehmbar Zytotoxizität im Laufe der Zeit kann mit dieser Methode quantifiziert werden. Die EpiAirway Modell kann auch für das Studium von Viren, Medikamente oder Chemikalien, die Auswirkungen des me...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25g </td><td> 1% in D-PBS ohne Calcium oder Magnesium-, Filter-sterilisiert </td></tr><tr><td> 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway Antibiotika-freien Geweben </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Geliefert mit kit </td></tr><tr><td> 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Verdünnen auf 1X vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,1% in 1 X PBS und Autoklaven </td></tr><tr><td> Difco GC Medium Base (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave 36 g in 500 ml ddH 2 O und kühl bis 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL Hämoglobin (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave 10 g in 500 ml ddH 2 O, kühl bis 60 ° C und vermischen sich mit der GC Basisnährboden oben </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX Anreicherung (Schokolade-Agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Das Gemisch von GC Basisnährboden und Hämoglobin bis 55 ° C und 10 ml rehydratisiert IsoVitaleX, pour Schokolade-Agar-Platten </td></tr><tr><td> Anatomische Pinzette, feine Spitze, gebogene </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Self-Abdichtung Sterilisation Beutel </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin-Sulfat, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Add 10 Mikroliter / ml bis EpiAirway MM für die Gentamicin töten </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sind Menschen angepassten Gram-negative Bakterien, die wiederkehrende und chronische Infektionen der Schleimhaut der Atemwege 1 Ursache kann; 2. Um die Mechanismen, mit denen diese Organismen an und im respiratorischen Gewebe überleben, ein Modell, in dem langfristig erfolgreiche Co-Kultur von Bakterien und menschlichen Zellen durchgeführt wird, gefordert werden kann, zu studieren. Wir verwenden primären humanen respiratorischen Epithelzellen Gewebe angehoben, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die EpiAirway Modell (MatTek, Ashland, MA). Diese sind nicht unsterblich, gut differenzierten, 3-dimensionale Gewebe, die Tight Junctions, Flimmer-und nonciliated Zellen, Becherzellen, dass Mucin zu produzieren, und behalten die Fähigkeit, Zytokine in Reaktion auf eine Infektion zu erzeugen enthalten. Diese biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege kann in einer Reihe von Arten verwendet werden; das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, langfristige Zusammenarbeit Kultur EpiAirway Gewebe mit NTHi und zu quantifizieren zellassoziierte und verinnerlicht Bakterien im Laufe der Zeit durchführen . Wie gut, kann Mucin Produktion und die Zytokin-Profil der infizierten Co-Kulturen bestimmt werden. Dieser Ansatz verbessert existierende Verfahren in, dass viele aktuelle Protokolle verwenden untergetaucht Mono-oder Transwell Kulturen von menschlichen Zellen, die nicht fähig sind, unterstützen bakterielle Infektionen über längere Perioden 3. Zum Beispiel, wenn ein Organismus in der darüber liegenden Medien replizieren kann, kann dies zu nicht akzeptablen Niveau der Zytotoxizität und der Verlust der Wirtszellen durch, verhaftete das Experiment. Die EpiAirway Modell ermöglicht die Charakterisierung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Ferner kann, da die Quelle für die EpiAirway ist normale menschliche tracheobronchialen Zellen anstatt einer immortalisierten Linie ist jeder eine ausgezeichnete Darstellung der tatsächlichen menschlichen oberen Atemwege Gewebe, sowohl in Struktur und in Funktion 4. Bei dieser Methode werden die EpiAirway Gewebe entwöhnt von anti-mikrobiellen und Anti-Pilz-Verbindungen für 2 Tage vor der Auslieferung, und alle Verfahren sind unter Antibiotika-freien Bedingungen durchgeführt. Dies erfordert besondere Überlegungen, da beide Bakterien und primären humanen Geweben in der gleichen Biosicherheitswerkbank verwendet werden und sind Co-Kultivierung über einen längeren Zeitraum.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Aufrufe.  Mercer University School of Medicine. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten In-vitro- Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.

Serie: Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...