Unser Protokoll erleichtert die Formulierung von Polymer-Nanopartikel-Hydrogelen für die Verwendung als Biomaterialien. Wir hoffen, dass die Forscher dieses Material für translationale Anwendungen und zur Erforschung grundlegender biologischer Fragen entwickeln werden. PNP-Hydrogele werden leicht durch Nadeln und Katheter mit kleinem Durchmesser injiziert, heilen sich aber nach der Injektion schnell selbst.
Dies ermöglicht die nicht-invasive kontrollierte Abgabe von Medikamenten und Zellen über lange Zeiträume. Diese Technologie verschiebt die Grenzen für eine lokalisierte Therapie und eine verlängerte Wirkstofffreisetzung mit Auswirkungen auf weitreichende Erkrankungen von Krebs über Geweberegeneration bis hin zur passiven Immunisierung. Um Nanopartikel durch Nanofällung zu synthetisieren, fügen Sie 50 Milligramm PEG-PLA-Polymer zu einer acht Milliliter Glasszintillationsfläschchen hinzu und fügen Sie ein Milliliter Acetonitril in die Durchstechflasche hinzu.
Wirbel vollständig aufzulösen. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter reinen Reinwassers zu einer 20-Milliliter-Glasszintillationsfläschchen mit einem kleinen Rührstab hinzu und legen Sie die Durchstechflasche auf eine Rührplatte, die auf 600 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um ein Milliliter der Polymerlösungslösung tropfenweise in die Durchstechflasche mit Wasser zu geben.
Kern-Hüllen-Nanopartikel bilden sich, wenn die Polymerlösung schnell im Wasser dispergiert wird. Überprüfen Sie die Partikelgröße durch dynamische Lichtstreuung nach Standardprotokollen. Anschließend wird die Nanopartikellösung in eine Zentrifugalfiltereinheit gegeben, um die Lösung auf weniger als 250 Mikroliter zu konzentrieren und die Nanopartikel in einem geeigneten Puffer wieder aufzubeleben.
Um das Hydrogel vorzubereiten, fügen Sie 333 Milligramm 6% HPMC-C12-Stammlösung zu einer Luer-Lock-Spritze mit einem Milliliter hinzu und fügen Sie 500 Mikroliter der 20% Nanopartikel-Stammlösung und 167 Mikroliter PBS zu einer Acht-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Nach dem Mischen mit einer Nadel eine weitere Milliliter Luer Lock Spritze mit der verdünnten Nanopartikellösung füllen und die beiden Spritzen an einem Ellenbogenmischer befestigen. Mischen Sie die beiden Lösungen für etwa 60 Zyklen, bis sich ein homogenes, undurchsichtiges weißes Hydrogelmaterial gebildet hat.
Um die rheologischen Eigenschaften des formulierten Hydrogels zu messen, injizieren Sie das entsprechende Hydrogelvolumen entsprechend dem ausgewählten Geometriespalt in die Mitte einer gezackten Rheometerplatte und verwenden Sie Oszillations- und Strömungstests, um die mechanischen Eigenschaften der Probe zu messen. Um die Wirkstofffreisetzung aus dem Hydrogel zu charakterisieren, bereiten Sie zunächst eine Glaskapillaren vor, indem Sie Epoxidharz verwenden, um ein Ende jedes Röhrchens zu versiegeln. Wenn sich das Epoxidharz eingestellt hat, verwenden Sie eine vier Zoll große hypodermische Nadel mit 22 Gauge, um 100 bis 200 Mikroliter Hydrogel in mindestens drei Röhrchen pro Probe zu injizieren, und fügen Sie vorsichtig 200 bis 300 Mikroliter PBS auf jedes Volumen Hydrogel hinzu.
Verwenden Sie zu den geeigneten Zeitpunkten entsprechend der erwarteten Zeitskala der Arzneimittelfreisetzung eine Nadel, um das PBS vorsichtig aus jeder Kapillare zu entfernen, ohne die Hydrogeloberfläche zu stören, und fügen Sie ein frisches PbS-Volumen hinzu. Analysieren Sie nach Abschluss der Studie die gesammelten PBS-Aliquoten mit einer geeigneten Methode, um die Menge des zu jedem Zeitpunkt freigesetzten Arzneimittels zu quantifizieren. Um die thermische Stabilität von gelverkapseltem Insulin zu charakterisieren, laden Sie sowohl Insulin als auch Thioflavin T wie gezeigt in das Hydrogel und verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 200 Mikroliter der Ladung und des mit Sonden beladenen Hydrogels in mindestens drei Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte pro Probe zu injizieren.
Dann versiegeln Sie die Platte mit einer optisch klaren Klebeplattendichtung, um Verdunstung zu verhindern, und führen Sie die Platte in einen Plattenleser ein, der mit Temperaturregelung, Schütteln und einer kinetischen Leseprogrammierung ausgestattet ist. Um die Lebensfähigkeit der hydrogelverkapselten Zellen zu beurteilen, verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 150 Mikroliter Hydrogel mit der entsprechenden Zellkonzentration in jede der drei Vertiefungen pro Probe in einer klaren unteren 96-Well-Platte zu injizieren und 100 Mikroliter des entsprechenden Zellmediums in jedes Hydrogelvolumen zu geben. Ersetzen Sie am ersten Tag der Kultur den Überstand auf jedem Hydrogel zum richtigen Zeitpunkt für jede Probengruppe durch 50 Mikroliter zwei millimollarer Calcein AM-Lösung.
Nach einer 30-minütigen Inkubation stellen Sie das Zentrum jedes Brunnens durch konfokale Mikroskopie ab. Um die Fähigkeit der verkapselten Zellen zu bewerten, sich vor der Injektion in einer Spritze absetzen, verdünnen Sie die interessierenden Zellen auf einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in PBS-Konzentration und färben Die Zellen mit 50 Mikrolitern von zwei Millimolaren Calcein AM für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation mischen Sie die Zellen mit 500 bis 700 Mikrolitern Hydrogel, wie gezeigt, und verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel, um 100 bis 200 Mikroliter Zell, die Hydrogel enthält, in den Boden von mindestens einer Küvette pro Probe zu injizieren.
Stellen Sie sich dann die Kuseten ab, die unmittelbar nach der Injektion und einein vier Stunden nach der Aussaat flach auf ihren Seiten auf der Stufe eines konfokalen Mikroskops liegen, um zu beobachten, ob sich die Zellen im Hydrogel angesiedelt haben oder ob sie suspendiert geblieben sind. Die Scherausdünnungs- und Selbstheilungskräfte des Gels können mit Flow-Sweep- bzw. Step-Shear-Protokollen beobachtet werden. Die Charakterisierung der Speicher- und Verlustmodule mittels eines oszillatorischen Scherfrequenz-Sweep-Experiments im linearen viskoelastischen Regime bei Frequenzbereichen von 0,1 bis 100 Bogenmaß pro Sekunde zeigt die feststoffähnlichen Eigenschaften.
Bei steiferen Formulierungen sollte typischerweise keine Kreuzung der Scherspeicher- und Verlustmodule beobachtet werden, während bei schwächeren Hydrogelformulierungen Crossover-Ereignisse zu erwarten sind. Die Variation des Polymergehalts der PNP-Hydrogele kann sich direkt auf die Diffusion der Ladung durch das Polymernetzwerk und die Freisetzungsrate aus den Materialien auswirken. PNP-Hydrogele können auch Ladung stabilisieren, die anfällig für thermische Instabilität ist, wodurch die Haltbarkeit der Ladung erheblich verlängert und die Abhängigkeit von kühlkettigen Lagerung und Verteilung verringert wird.
Die Einbeziehung von Integrinmotiven kann nützlich sein, um PNP-Hydrogele für Zelltherapien anzupassen. Verkapselte Zellen können fluoreszierend markiert werden, um ihre Visualisierung und Quantifizierung zu erleichtern. Zum Beispiel haben Formulierungen ohne Adhäsionsstellen eine geringe Zelllebensfähigkeit, da sich verkapselte Zellen im Vergleich zu verkapselten Zellen und Formulierungen mit Adhäsionsmotiven wie RGD nicht vermehren.
Wir untersuchen noch, wie sich Änderungen in der Formulierung auf die rheologischen Eigenschaften und das dynamische Netz der Polymermatrix auswirken. Wir verwenden FRAP auch, um die Diffusion von Molekülen im Hydrogel zu untersuchen. Diese Materialien können verwendet werden, um neue biologische Fragen darüber zu stellen, wie sich eine nachhaltige Verabreichung auf die Medikamentenabgabe, die Impfstoffentwicklung oder die Krebsimmuntherapie auswirken könnte.
