Signalwege, die multizelluläre Systeme steuern, sind dynamisch. Um die Funktion dieser Dynamik zu verstehen, ist es wichtig, diese Dynamik subtil modulieren zu können, ohne die gesamte Signalisierungsaktivität zu beeinträchtigen. Dieses Protokoll verwendet ein mikrofluidisches System, das eine funktionelle Dissektion von Signalschwingungen in sich entwickelnden Mausembryonen ermöglicht.
Signaldynamiken wurden in vielen Geweben gefunden, einschließlich erwachsener. Die Mikrofluidik ist ein vielseitiges Werkzeug, das an viele Modellsysteme angepasst werden kann, einschließlich Zell-, Gewebe- und Organoidkulturen. Bereiten Sie zunächst die erforderliche Menge an PDMS vor, indem Sie das Monomer mit dem Katalysator in einem Verhältnis von neun zu eins mischen, um eine Polymerisation zu induzieren.
Verwenden Sie Einwegwerkzeuge und stellen Sie sicher, dass das Mischen ordnungsgemäß erreicht wird. Legen Sie die PDMS-Mischung in einen Exsikkator und tragen Sie etwa 30 Minuten lang Vakuum auf, um Luft zu entfernen. Gießen Sie eine PDMS-Schicht von etwa drei bis fünf Millimetern in die Chipform und geben Sie sie für ca. 30 Minuten wieder in den Exsikkator.
Härten Sie die Form aus, indem Sie sie je nach Formmaterial über Nacht bei 65 Grad Celsius oder weniger in einen Ofen stellen. Schneiden Sie den Chip mit einem Skalpell aus der Form. Stanzen Sie Einlass- und Auslasslöcher mit einem Ein-Millimeter-Biopsiestempel, beginnend mit der Innenseite der mikrofluidischen Kammer.
Reinigen Sie den Glasschieber mit Druckluft. Um den Chip mit dem Glasobjektträger zu verbinden, legen Sie den Chip und den Glasschieber mit den zu verklebenden Seiten nach oben in den Plasmaofen. Erzeugen Sie Plasma unter Verwendung des für die verwendete Maschine spezifischen Protokolls und verbinden Sie den Chip dann mit dem Glas, indem Sie die aktivierten Oberflächen aufeinander legen und gleichmäßig Druck ausüben.
Um den Schlauch und den Chip für das Experiment vorzubereiten, schneiden Sie den Schlauch in einem Winkel von 45 Grad und befestigen Sie eine Nadel an jedem der Schläuche. Legen Sie den Schlauch mit Nadeln, dem Chip und den Plugs in eine Schale und sterilisieren Sie sie, indem Sie sie etwa 15 Minuten lang ultraviolettem Licht aussetzen. Um den Chip mit Fibronektin zu beschichten, legen Sie den Chip bei Raumtemperatur in ein Becherglas, das PBS plus 1% Penicillin oder Streptomycin enthält.
Spülen Sie den Chip mit PBS, um Luft mit einer P200-Pipette zu entfernen. Laden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze für jede Kammer des Chips. Befestigen Sie die Nadel an der Spritze, die Fibronektin enthält, und schließen Sie die Spritze an die Spritzenpumpe an.
Spülen Sie die Schläuche manuell, um Luft zu entfernen. Befestigen Sie den Auslassschlauch am Auslass des Chips. Stellen Sie sicher, dass Sie den Schlauch ganz nach unten drücken und eine niedrige Durchflussrate einstellen, um den Chip zu beschichten.
Lassen Sie die Spritzenpumpe mindestens zwei Stunden oder über Nacht laufen. Wenn Sie fertig sind, stoppen Sie die Pumpe und schneiden Sie den Schlauch direkt nach der Nadel ab. Bereiten Sie mit dem Medium gefüllte Spritzen für das Experiment vor und entgasen Sie sowohl das Kulturmedium als auch den Chip in PBS.
Versuchen Sie, die meisten Luftblasen aus dem Chip auszuspülen oder aufzusaugen, installieren Sie dann Spritzen in den Pumpen und befestigen Sie Einlassschläuche an den Spritzen. Um Gewebe auf den Chip zu laden, sezieren Sie die hinterste Spitze des Schwanzes. Spülen Sie den Chip mit Kulturmedium mit 25 mikromolaren HEPEs, um das PBS zu entfernen.
Laden Sie das Gewebe mit einer P200-Pipette in den Chip. Schließen Sie nach jedem Gewebeladeschritt den entsprechenden Gewebeladeeinlass mit einem Stück PDMS-gefülltem Schlauch. Um das mikrofluidische Setup zusammenzubauen, befestigen Sie Schläuche am Mikrofluidikchip, ohne Luftblasen ins Innere zu bekommen.
Stellen Sie dazu sicher, dass am Ende des Schlauches ein Tropfen Medium vorhanden ist. Sobald alle Schläuche am Chip befestigt sind, nehmen Sie ihn aus dem Becherglas und legen Sie ihn in eine Schale, die ein nasses Gewebe enthält. Legen Sie die Schale und ca. 1,5 Meter Einlassschlauch in einen Inkubator für die Kultur über Nacht.
Sorgen Sie für eine hohe Luftfeuchtigkeit, um die Bildung von Luftblasen während der Kultur zu verhindern. Alternativ trocknen Sie die Außenseite des Chips und legen Sie ihn in einen Mikroskophalter, dann legen Sie den Halter und etwa 1,5 Meter Einlassschlauch in die Inkubationskammer eines inversen Mikroskops für ein Live-Bildgebungsexperiment. Beginnen Sie nach mindestens 20 Minuten konstantem Durchfluss mit dem geplanten Pumpen für das Experiment.
Um die Kerbsignalisierung im segmentierenden Mausembryo zu integrieren, verwenden Sie ein Pumpprogramm von 100 Minuten mittleren und 30 Minuten Medikamentenimpulsen, die bis zum Ende des Experiments wiederholt werden, typischerweise für 24 Stunden. Für Echtzeit-Bildgebung beginnen Sie nach mindestens 30 Minuten mit der Bildgebung. Um die Mitnahme von Signalschwingungen zu bestätigen, werden mehrere Experimente unter Verwendung des Timings der Wirkstoffimpulse ausgerichtet und mit dem Farbstoff Cascade Blue visualisiert.
Quantifizierte Schwingungen können detrendiert und als Mittelwert dargestellt und Standardabweichung oder Phasen der Schwingungen berechnet werden. Die Phasenbeziehung zwischen Schwingungen unabhängiger hinterer Embryokulturen zueinander und zu den äußeren Wirkstoffpulsen kann analysiert werden. Zur Bestätigung der Mitnahme kann man z.B. mit dem Python-basierten Programm pyBOAT den Zeitraum der endogenen Signalschwingungen bestimmen.
Bei der Anwendung von Impulsen mit einer Periode von 130 Minuten zeigen Notch-Signalschwingungen ebenfalls eine Periode von 130 Minuten. Es ist wichtig, die Verdunstung von Flüssigkeit während des mikrofluidischen Experiments zu verhindern. Andernfalls bilden sich im Chip Luftblasen, die den mittleren Fluss stören.
Um dies zu verhindern, entgasen Sie das Medium und den Chip und achten Sie darauf, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch genug ist. Mit dieser Methode kann die Signaldynamik moduliert und ihre Auswirkungen durch Echtzeit-Bildgebung von fluoreszierenden Reportern, Immunfärbungen oder In-situ-Hybridisierung analysiert werden. Darüber hinaus kann das Gewebe auch zur weiteren Analyse aus dem Chip extrahiert werden.
Man kann diese Methode verwenden, um die Funktion von Signalschwingungen in der Embryonalentwicklung zu untersuchen. Es wurde angewendet, um die Bedeutung der Phasenverschiebung zwischen zwei oszillierenden Signalwegen für die Segmentierung des Mausembryos zu demonstrieren. Allgemeiner kann es nun verwendet werden, um den Mechanismus der dynamischen Signalkodierung in mehrzelligen Systemen zu sezieren.
