Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Wir danken Amayra Hernandez-Vega und Philippe Alexandre Pouille für die Teilnahme an die Grundlage für diese Protokolle einrichten. Wir danken auch der Molecular Imaging Plattform vom IBMB-PCB, Xavier Esteban und Mitglieder des Labors für kontinuierliche Unterstützung. Das konsolidierte Gruppen Programm der Generalitat de Catalunya und DGI und Consolider Zuschüsse aus dem Ministerium für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit von Spanien, EMB und DN unterstützt diese Arbeit.

Alle Protokoll-Schritte, die unten beschriebenen Anweisungen Tierbetreuung unserer Institutionen.
(1) Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Züchten Sie und pflegen Sie Erwachsene Zebrafisch unter Standardbedingungen. Hinweis: AB und TL Wildtyp-Embryonen wurden für diese Studie verwendet.</li>
	<li>Sammeln Sie Embryonen zu und wachsen sie in E3 Embryo mittlere24bei 28,5 ° C. Inszenieren sie nach Morphologie als zuvor beschriebenen19.</li>
</ol>(2) Rasterkraftmikroskopie
<ol><li>Manuell Dechorionate inszeniert Zebrafisch-Embryonen (aller Altersgruppen nach individuellen Interessen). Entfernen Sie Chorions mit zwei dünnen und scharfen Pinzetten (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Das Chorion mit einer Pinzette greifen und es mit anderen Zangen eine Träne machen. Dann hält das Chorion in einer Region entgegengesetzt zu der des Risses, den Embryo vorsichtig durch die Öffnung schieben.</li>
		<li>Führen Sie die Dechorionation unter einen sezierenden Stereomikroskop mit einem einstellbaren Bereich der Vergrößerung von 8 X bis 50 X.</li>
	</ol></li>
	<li>Montieren Sie die Embryonen für AFM
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Agarose im Embryo Medium und füllen Sie einer 35-mm-Petrischale damit. Lassen Sie es zu festigen. Machen Sie kleine Löcher von 1,5 mm Durchmesser (doppelt so groß wie Embryo) und ca. 350 µm Tiefe (Hälfte der Embryo Größe) mit dünnen Pinzette in die Agarose-Bett.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die Pokes gemacht in der Agarose-Schicht und versichern Sie, dass sie im Ort durch die Verbreitung rund um eine Lösung von 0,5 % niedrige Agarose im Embryo Medium schmelzen. Gießen Sie diese Lösung, um nur die Embryonen in den Löchern befestigen.</li>
		<li>Bevor die niedrigen Schmelzpunktes Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, drehen Sie die Embryonen in einer Weise, dass die Region von Interesse von AFM sondiert werden nach oben (Abbildung 1A) konfrontiert sein wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Untersuchen Sie die Embryonen von AFM
	<ol>
<li>Suchen Sie und Bild die Embryos in der Petrischale mit einem 20 X Objektiv in einem Inverted Atomic Force Microscope (siehe Tabelle der Materialien25) bei Zimmertemperatur (23-24 ° C). Hinweis: Die Embryonen sind lebendig gehalten, inmitten der Embryo Medium und an die Agarose-Bett.</li>
		<li>Sondieren Sie die Eigelb Zellenoberfläche gegossen Embryonen mit sphärischen Polystyrol-Kügelchen von 4,5 µm im Durchmesser befestigt, ein Freischwinger mit einem nominalen Federkonstante von 0,01 N/m. Peak to Peak Amplitude der Freischwinger Schwingung auf 5 µm und seine Frequenz von 1 Hz eingestellt.</li>
		<li>Sammeln Sie Daten für jede Region in verschiedenen Positionen und in mehrere Embryonen als eine Routine für die Mittelung der Daten getestet werden. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist fünf Positionen befindet sich in der Mitte und an den Ecken eines Quadrats µm 10 µm X 10 Steuerung Freischwinger mit XY Piezo-Aktuatoren der AFM Mikroskop zu untersuchen. Bildgebung und Datenerhebung dauerte rund 20 Minuten pro Embryo. Datenaufzeichnung in verschiedenen Regionen der Embryo Eigelb Zellenoberfläche, z.B.die Vegetal Pfosten oder verschiedene Regionen in der Nähe der EVL Zellen Rand (Abbildung 1 b und 1 C), geht nur durch den Einsatz von unterschiedlicher Proben unterschiedlich orientierte.</li>
	</ol></li>
	<li>Kräfte zu berechnen
	<ol>
<li>Messen Sie die vertikale Verschiebung der AFM Cantilever (Z) mit DMS-Sensoren mit Piezo-Aktuatoren und ihre Ablenkung (d) mit einem Quadranten Photodiode durch die optische Hebel-Methode mit dem Mikroskop-Steuerungs-Software gekoppelt (siehe Tabelle der Materialien ( 25).</li>
		<li>Verwenden Sie die Neigung einer gewonnenen Daten aus einer bloßen Region von einem Glas Deckgläschen d-Z-Kurve, um die Korrelation zwischen der Photodiode Signal und die Cantilever-Auslenkung (d) zu kalibrieren. Hinweis: Die gemessene vertikale Verschiebung entspricht die Cantilever-Durchbiegung und die Steigung stellt die Ablenkung Empfindlichkeit der optischen Hebel26.</li>
		<li>Folgern Sie, dass die Freischwinger Federkonstante (k) von den thermischen Fluktuationen27wie oben beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie die Einrückung der Probe (h) als: h = (Z - Z-c) -(d - daus)          (1) Hinweis: Hier Zc ist die Position der Kontaktstelle und daus ist der Offset der Fotodiode.</li>
		<li>Berechnen Sie die Kraft (F) auf der Cantilever als: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Spannung des Kortex in Bezug auf eine Flüssigkeit-Ballon-Modell, bestehend aus einer Elastikschicht kortikalen Spannung Tc umschließt eine zähe Flüssigkeit. In diesem Modell für kleine Vertiefungen (im Vergleich zur Größe des Embryos), steigt Kraft proportional4,28 als: F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) Hinweis: Hier Rb ist der Radius des Wulstes und e R ist der Radius des Embryos. Für Zebrafish Embryos wie der Radius des Embryos (400 µm) zwei Größenordnungen größer ist als die des Wulstes (2,25 µm), ist kann diese Gleichung als angenähert werden: F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>Berechnen Sie die Spannung Kraft-Einrückung (F-h) Kurven in jeder Embryo Eigelb Zelle Region für fünf verschiedene Punktmessungen.</li>
		<li>Tc für jede F-h -Kurve durch nichtlineare kleinste-Quadrate passend zu berechnen. Für statistische Analysen, die kortikale Spannung Tc berechnet aus den verschiedenen F-h Kurven gemittelt werden muss.</li>
	</ol></li>
	<li>Die viskoelastischen Eigenschaften (Rheologie) des Kortex mittels niedrigen Amplitude messen (100 nm) Multifrequenz Schwingungen bei AFM bestehend aus sinusförmigen Wellen mit unterschiedlichen Frequenzen25.
	<ol>
<li>Eine effektive komplexen Modulus g*(ƒ) im Frequenzbereich von Kraft Einzug Kurven als zu berechnen: g * (f) = [F(f) / h(f)]- Ifb (5) hier i ist die imaginäre Einheit und F(f) und h(f) sind die Frequenzspektren (f) der Kraft und der Einzug. b ist die Korrektur für das zähflüssige ziehen auf der Cantilever entzogen die Schwingungen auf die Oberfläche aufgetragen.</li>
		<li>Separate g*(ƒ) in realen und imaginären Teile wie: g * (Ƒ) = g' (f) + Ig'' (f)          (6) Em > g'(f) ist der Elastizitätsmodul und ist ein Maß für die elastischen Energie gespeichert und wiederhergestellt pro Zyklus der Schwingung. g'' (f) ist der viskosen Modulus, die Konten für die Verlustleistung.</li>
		<li>Berechnen Sie die Tangente Verlust, sorgt für einen Index von fest-wie (< 1) oder Flüssigkeit-wie (> 1) Verhalten des Materials, wie: g'' (f) / g"(f)          (7) Hinweis: Mit dieser Art der Messung ist es möglich, Parameter zu extrahieren angibt wie Viskose und wie elastisch der sondierten Material ist. Obwohl b leicht von der Entfernung des Endes des Nadelträgers an die Oberfläche hängt, angesichts der sehr niedrige Werte von g´´ ausgestellt durch das Eigelb (siehe unten Abbildung 2D ), kleine Abweichungen in b haben einen vernachlässigbaren Einfluss in die Messungen29.</li>
	</ol></li>
</ol>(3) Particle Tracking Microrheology
<ol><li>
Führen Sie Partikel Mikroinjektion in die Eigelb-Zelle
	<ol>
<li>Fertigen Sie maßgeschneiderte Mikronadeln mit einem horizontalen Mikropipette Puller und Kapillare Borosilikatglas (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Bereiten Sie Mikronadeln, die einen Außendurchmesser von 1,00 mm, einen Innendurchmesser von 0,58 mm und einer Länge von 10 cm mit Puller-Einstellungen haben: Druck: 500; Hitze: 510; Ziehen: 65; Geschwindigkeit: 25; Zeit: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vorbereiten einer Injektion Petrischale Platte durch die Schaffung von geraden Einzug Bahnen in einem 1 % Agarose im Embryo mittlere Bett mit benutzerdefinierten gemacht Formen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Drehen Sie die Formen um und legen Sie sie auf das flüssige Agarosegel und entfernen Sie den Schimmel zu, sobald das Gel verfestigt hat. Pipette die Embryonen in die Nuten von der Form in der Agarose unter einen sezierenden Stereomikroskop bei 1,2 X Vergrößerung gemacht. Hinweis: Die Breite und das Design der Werkzeuge ermöglichen die Embryonen selbst ausrichten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vor der Injektion fast vollständig entfernen Sie das Medium, um die Injektion zu erleichtern (die Oberflächenspannung verhindert, dass der Embryo/Chorion festhalten an der Nadel, wenn es nach der Injektion zu entfernen).</li>
		<li>Microinject fluoreszierende Nanopartikel (Radius einer = 100 nm, siehe Tabelle der Materialien) verdünnt in Wasser (1:1 000) im pflanzlichen Teil der Embryo Eigelb Zelle (Abb. 3A).</li>
		<li>Passen Sie die Mikropipette mit Präzision Mikromanipulatoren und injizieren Sie die Perlen mit einer automatischen Microinjector mit Zeit und Druck-Regler (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie den Druck zwischen 10 und 20 Psi.</li>
		<li>Vor der Injektion der Wulst Lösung, kalibrieren Sie das Volumen zu injizieren (0,5 nL) durch Messung der Tröpfchengröße geliefert durch die Microinjector mit einem 1 x 0,01 mm Bühne Mikrometer (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Beschäftigen Sie eine Vergrößerung von 1,6 X in den sezierenden Stereomikroskop, die Embryonen während der Injektionen zu visualisieren, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Das viskoelastische Verhalten das Eigelb durch thermische Fluktuationen Aufzeichnung zu bewerten
	<ol>
<li>Dechorionate die microinjected Embryonen wie in Schritt 2.1 und eingebettet in eine 0,5 % niedrige Schmelz-Punkt Agarose im Embryo mittlere Lösung bei 30 ° C. Anschließend übertragen Sie sie auf Glasplatten unten (siehe Tabelle der Materialien) und orientieren Sie und schieben Sie sie auf das Deckglas, wenn die Agarose noch flüssig ist. Hinweis: Wenn die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, können die Embryonen abgebildet werden.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die unteren Glasplatten auf der Bühne von einem konfokalen umgekehrtes Mikroskop 2 h nach Mikroinjektion montiert. Die Aufnahmen der Nanopartikel für 26 s bei einer Sampling-Rate von 25 Hz mit einer 63 X Objektiv bei Raumtemperatur in einer invertierten confocal Mikroskop beschäftigt die standard kommerzielle Mikroskop-Software (Pixelgröße = 166 nm, Bilder, die alle 40 ms).</li>
		<li>Berechnen Sie die Position der Partikel Zentroiden zu und definieren Sie ihre Flugbahnen im Laufe der Zeit mit dem TrackMate-Plugin von open Source Software ImageJ (Abb. 3 b).</li>
		<li>Berechnen Sie die zweidimensionale mittlere quadratische Verschiebung (MSD) jedes Partikels mit maßgeschneiderten Software6,30 als: < ΔR2 (τ) > = < [X(t + τ) - X(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Hinweis: Hier ist t die verstrichene Zeit und die zeitliche Verzögerung. In einer reinen viskose Flüssigkeit steigt die MSD umgekehrt mit Viskosität (ν) nach der Stokes-Einstein-Beziehung: < ΔR2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) wobei T die Absolute Temperatur ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. 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Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Hier zeigen wir, dass die Materialeigenschaften und einige biomechanischen Parameter der Zebrafisch Eigelb Zelle während der Epiboly von AFM und Nanopartikel Microrheology leicht geschätzt werden können.
Während AFM, zum Abrufen von rheologischer Eigenschaften von Zellen und Geweben in physiologischen Bedingungen4,5,25,28 beschäftigt war, haben hier wir ein Prot...

Die physikalischen Grundsätze der biomechanischen Kontrolle der morphogenetischen Prozesse sind weitgehend undefiniert. Während biomechanische Untersuchungen auf molekularer und zellulärer Ebene erhebliche an Schwung, ist die Erforschung der biomechanischen Parameter der Ebene der Gewebe/Organismus in seiner Kindheit. Hydrodynamische Regression1 oder Video-Kraft-Mikroskopie2 Forscher, aktive und passive Kräfte, während der Laser Mikrochirurgie3oder weniger aufdringlich Rasterkraftmikroskopie (AFM) dissoziierten Zellen4 unterscheiden können oder in vivo 5 oder Nanopartikel Microrheology6 erlauben die Vorfreude der mechanischen Eigenschaften und Reaktionen des Gewebes.
AFM ist eine dreidimensionale topographische Technik mit hoher atomarer Auflösung Oberflächenrauhigkeit und Compliance aus der Durchbiegung der Freischwinger Tipps beim Kontakt mit einem sondierten Oberfläche7zu lösen. Verschiedene Methoden mit AFM wurden entwickelt, um Oberflächeneigenschaften, einschließlich der Messung von Reibung, Adhäsionskräfte und viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu untersuchen. AFM hat vor kurzem ein mächtiges Werkzeug zum Abrufen von Informationen auf die mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben entwickelt. AFM kann insbesondere nicht-invasiv der komplexe Schubmodul aus einzelnen Zellen extrahieren, durch die Anwendung von oszillierender Vertiefungen mit einem Mikro Spitze an einem Freischwinger von bekannten Biegung konstant8befestigt. Dadurch können wir die daraus resultierenden Kräfte abzuleiten. Doch AFM ist nicht eindeutig und verschiedene Methoden erlauben extrahieren Daten rheologischen und mechanischen Eigenschaften von einzelnen Zellen (z. B. Mikropipette streben9, magnetische Zytometrie (MTC)10verdrehen oder einachsigen Zug- 11Tests).
Die Anwendung dieser neuartigen Methoden komplexe morphogenetischen Prozesse ist jedoch nicht einfach. Die größten Herausforderungen bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebe sind die kleinen (µm bis mm), weich (in den 102 - 104 -Pa-Bereich) und Visco-elastische (entstehen auf zeitabhängige Phänomene) Natur der materiellen12. Es ist daher wichtig, die Methoden zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit, Viskosität, Adhäsion) auf den konkreten Fall von Embryonen und entwickelnden Organismen anzupassen. Zwei wichtige Punkte müssen berücksichtigt werden bei der Analyse der rheologische Ansätze zur Entwicklung zu studieren: aufdringlich Störungen zu vermeiden und gute Erreichbarkeit. In diesem Szenario zeigen Mikropipette Aspiration, MTC und Zugprüfung Einschränkungen. Im ersten Fall könnte die hohe Verformung, die eine Zelle leidet seine physiologischen und mechanischen Eigenschaften9ändern. Im zweiten Fall könnte die Notwendigkeit, sich fest das experimentelle Gewebe auf ein Substrat um sicherzustellen, dass die Spannungen angewendet das Zellskelett lokal verformen auch Auswirkungen auf die Zellen der Aktivierungsstatus und daher in ihrer mechanischen Eigenschaften10 bringen. . Letzte, einachsigen Zug-Ansätze werden durch die Geometrie der Entwicklung von Organismen und Zugänglichkeit11begrenzt.
AFM scheint für das Studium der Entwicklungsprozesse besser geeignet sein, wie es die Untersuchung von biologischen Proben direkt in ihrer natürlichen Umgebung ohne umständliche Probenvorbereitung ermöglicht. Darüber hinaus wie Dissoziation des embryonalen Gewebe in der Regel schwierig ist, bietet die geringere Größe der AFM Sonden ein hohes Maß an Vielseitigkeit ohne Einschränkung bei der Wahl der Art des Mediums (wässrige oder nichtwässrigen), Probentemperatur oder chemische Zusammensetzung der Probe. AFM ist vielseitig genug, um auf große Domänen angewendet werden und Zeitskalen und zum Abrufen von Eigenschaften von Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder physiologischen Bedingungen beschäftigt. Gesamten nativen Gewebe wie Arterien13 oder Knochen14 untersucht worden sind, aus Sicht der topographischen und in einigen Fällen, wie der Sklera, mechanische Eigenschaften wurden auch abgerufen am15. Topographie ist auch in live ermöglicht die Visualisierung von zum Beispiel Zelle Umlagerung während Morphogenese Xenopus16Embryonen untersucht worden. Letzten, umfassenden Stichprobe Vorbereitung Protokolle wurden entwickelt, um mechanische Parameter zu bestimmen, während verschiedene Entwicklungsprozesse. Nanoindentation Karten wurden auf native fixierten Gewebeschnitten für die Küken embryonalen Verdauungstrakt11generiert; Kleber und mechanische Eigenschaften für einzelne Ektoderm, Mesoderm und Entoderm Progenitor-Zellen isoliert von gastrulating Zebrafish Embryos4abgerufen; Steifigkeit Messungen für die Epiblast und primitive Streak auf Explantaten von Vogelgrippe Embryonen17; und ein eindeutiges Muster von Steifigkeit Gradienten direkt im embryonalen Gehirn von Xenopus5definiert.
Annäherung an einfach zugänglichen morphogenetischen Prozesse kann ein erheblicher Qualitätssprung für die Anwendung von AFM für die Erkundung der Embryonalentwicklung entstehen. Zebrafisch-Epiboly ist ein wesentlicher und konservierte Ereignis, in dem verschiedene Geweben auf engstem Raum kugelförmig um den Ausbau der Blastoderm in wenigen Stunden direkte koordinieren. Zu Beginn der Zebrafisch Epiboly (sphärische Bühne) deckt eine oberflächliche Schicht von Zellen, die umhüllende Schicht (EVL), eine halbkugelförmige Kappe von Blastomeren auf die Tier-Pole des Embryos sitzt auf einer massiven Eigelb syncytial Zelle zentriert. Epiboly besteht aus den kortikalen pflanzlichen Ward Ausbau der EVL die tiefen Zellen (DCs) das Blastoderm und die äußere Schicht der syncytial Eigelb Zelle (E-YSL) um den Dotter. Epiboly endet mit der Schließung der EVL und die DCs Vegetal Pfosten18,19,20. Wie und wo Kräfte während Epiboly generiert werden und wie sie weltweit gekoppelt sind, ist nicht noch klar,1,21.
Hier beschreiben wir im Detail wie AFM zu folgern, dass passive mechanische Gewebeeigenschaften während Epiboly Progression im Zebrafisch Eigelb in VivoZelle angewendet. Dazu haben wir kleine Mikrosphären mit AFM Kragarmen als Sonden verbunden beschäftigt. Dies ermöglicht den Abruf von präzise lokale Informationen innerhalb der Zelloberfläche ungleichmäßige Eigelb und Zug Steigungen und ihre Dynamik im Laufe der Zeit zu studieren. Alternative AFM nähert sich z. B. die Verwendung von Keil Kragarme22, wird nicht Lokaldaten Render, die präzise genug ist. Die Keil-Technik, die sehr sorgfältige Handhabung Fähigkeiten, um einen Keil größer als die Größe der Stichprobe am Ende des Nadelträgers kleben erfordert, eignet sich nicht zum sondieren Embryo (~ 2-fach größer als die Länge des Nadelträgers) Mechanik.
Modellierung und Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der Zellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht ermöglicht ein besseres Verständnis für die Biomechanik. Aus biomechanischer Sicht ist es wichtig zu verstehen, Epiboly und nicht nur Nachfrage wissen über Messungen der kortikalen Spannung und Dynamik, die durch AFM extrahiert werden können; so gibt es Bedarf an Informationen über die biophysikalischen Eigenschaften des Gewebes. Um diese Informationen zu extrahieren, eine Vielzahl von Zelle Rheologie Techniken wurden entwickelt, in den Jahren um verschiedene Zelltypen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen23charakterisieren. Dazu gehören AFM, MTC und optische Pinzette (OT). Diese Methoden sind jedoch unzureichend für mesoskopische Analysen auf der Ebene der Embryonen oder Organen nachgewiesen worden. Als Alternative haben wir erfolgreich Nanopartikel-Tracking Microrheology6 für in Vivo rheologischen Messungen angepasst. Diese Technik analysiert die Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel und schließt lokale mikromechanische Eigenschaften.
Zusammen AFM und Nanopartikel Microrheology erlauben die Definition der kortikalen Zug Dynamik und internen mechanischen Eigenschaften von Eigelb während Epiboly. Diese Informationen unterstützt voll und ganz eine Modell in dem anisotropen Stress entwickelt sich als Folge der Unterschiede in der Verformung Antwort von der EVL und die Eigelb zytoplasmatischen Schicht (YCL) zu den isotropen Actomyosin Kontraktion des E-YSL Kortex ist wichtig für net Richtungsbewegung der EVL und Epiboly Progression1.

<table><tbody><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td></tr><tr><td>Atomic force microscope (AFM)</td><td>Custom made</td><td>-</td><td>Any commercialized AFM could be employed</td></tr><tr><td>Inverted Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Casting embryos</td></tr><tr><td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Securing embryos</td></tr><tr><td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; cantilever</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &amp;micro;m diameter and k=0.01 N/m</td></tr><tr><td>Fluorescent nanoparticles</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,</td><td>For tracking nanorheology</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Borosilicate capillary glass</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulating the micropipette</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Controlling injection time and pressure</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualization of the embryos during injection</td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyzing AFM and particle tracking data</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB and TL wild type</td><td>-</td><td>Strains employed for embryo collection</td></tr><tr><td>Glass Bottom Plates</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Measuring injection volume</td></tr></tbody></table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Aufklärung der Faktoren, die die räumlich-zeitliche Organisation der sich entwickelnden Gewebe direkt ist einer der Hauptgründe für die Verwendung in der Studie der Entwicklung. Verschiedene Thesen behaupten, wichtige Beiträge zum Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben in ihrer raumzeitlichen Organisation in verschiedenen Entwicklungs- und morphogenetischen Prozessen gewesen zu sein. Jedoch wegen des Mangels an zuverlässige und zugängliche Tools zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo, war Überprüfung dieser Hypothesen schwierig. Hier stellen wir Ihnen Methoden beschäftigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Teilchen verfolgen mit dem Ziel, die mechanischen Eigenschaften der intakten Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Epiboly ist eine frühe konservierten Entwicklungsprozess, dessen Studie durch die Transparenz des Embryos erleichtert wird. Diese Methoden sind einfach zu implementieren, zuverlässig und vielseitig einsetzbar, da sie aufdringliche Interventionen überwinden, die Gewebe Mechanik beeinflussen könnten. Eine einfache Strategie wurde für die Montage von Proben, AFM-Aufnahme und Nanopartikel-Injektionen und Nachverfolgung angewendet. Dieser Ansatz macht diese Methoden leicht anpassbar an andere Entwicklungsstörungen Zeiten oder Organismen.

Kortikale Spannung Messungen Für jeden Messpunkt wurden fünf Kraft-Weg (F-Z)-Kurven von AFM erworben, durch Rampen der Cantilever bei 1 Hz mit einer Spitze-Spitze-Amplitude von 5 µm (Geschwindigkeit = 10 µm/s) bis zu einer maximalen Einbuchtung von ~ 2 µm. Dieses Verfahren dauerte weniger als 20 min und war nicht betroffen von Epiboly fortschreiten. Jede experimentelle Bedingung wurde in mindestens 5 Embryonen getestet.
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Aufrufe.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

Serie: AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurowissenschaften

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinertes Multiview-Lichtblattmikroskopie-Protokoll für Zebrafischembryonen

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Strategien für die Montage von Zebrafischembryonen für die hochauflösende Multiview-Lichtblattmikroskopie — Techniken zur Bildgebung und Bild

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen