Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), der Canada Foundation for Innovation (# 13199), Prostatakrebs Kanada, Janssen Onkologie, dem London Regional Cancer Program, und die Unterstützung der Geber von John und Donna Bristol unterstützt durch die London Health Sciences Foundation (ALA). UEG wird von einem Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Scholarship-Doktorandenpreis unterstützt. ALA wird von einem CIHR New Investigator Award und einer früh Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation unterstützt.

Alle in diesem Manuskript beschrieben Humanstudien wurden unter Protokolle durch Western University Human Research Ethics Board genehmigt durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care unter Protokolle, die von der Western University Einsatz von Tieren Unterausschuss genehmigt, durchgeführt. 1. Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben Mit der CSS 1. Menschliches Blut Probenahme und Probenvorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument <ol><li> Mit Standard-aseptischen Aderlass Techniken zeichnen ein Minimum von 8,0 ml von menschlichem Blut in ein 10 ml Cellsave Röhre, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und eine proprietäre Zellkonservierungsmittel enthält (im Folgenden als die CTC Konservierungsrohr bezeichnet). Das Röhrchen 5x bis Blutgerinnung verhindern. Proben können sofort weiterverarbeitet oder bei Raumtemperatur für bis zu 96 Stunden gelagert werden. </li><li> RemovE CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie. </li><li> Mit einer Pipette 10 ml Einweg-und automatisierte Pipette, sammeln 7,5 ml Blut aus der CTC Konservierungsrohr und langsam verzichten Blut in einem entsprechend gekennzeichneten Vorbereitung Instrumentenaufbereitung Röhre. </li><li> Hinzufügen von 6,5 ml Verdünnungspuffer zu jeder Probe. Mischen durch Umdrehen Probe 5x. Centrifuge Probe bei 800 g für 10 min mit der Bremse in der &quot;Aus&quot;-Position. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Patientenproben auf das System für die Verarbeitung zu laden. Die Proben müssen innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung verarbeitet werden. </li></ol> 2. Kontrolle Vorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument <ol><li> Vortexen Sie vorsichtig die Kontrollfläschchen und invertieren 5x zu mischen. </li><li> Den Deckel vorsichtig aus dem Kontrollfläschchen und legen eine umgekehrte Zubereitung Instrumentenaufbereitung Rohr auf der Oberseite des nicht verschlossenen Röhrchen. In einer schnellen Bewegung, kehren dieKontrolle Fläschchen, und gießen Sie den Inhalt in die Verarbeitung Röhre. Während umgekehrt ist, vorsichtig blättern Sie die Seiten der Kontrollfläschchen, um alle verbleibenden Inhalt freigeben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das invertierte Steuer Fläschchen aus der Verarbeitung Röhre, so dass keine Flüssigkeit verloren geht und legen sie beiseite. Mit einer 1000 ul Pipette, sammeln alle restlichen Inhalt aus der Flasche und Deckel und sanft in die Verarbeitung Röhrchen zu pipettieren. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, auf dem Instrument, um die Vorbereitung auf das Steuersystem für die Verarbeitung zu laden. </li></ol> 3. Beispiel Scannen über die Analyse-Instrument <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Proben aus dem System zu entladen. Lose Kappe jedes magnetische Vorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken freizugeben. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und ichncubate im Dunkeln für mindestens 20 min bei Raumtemperatur. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden. </li><li> Schalten Sie das Analyseinstrument und initialisieren Sie die Lampe. Sobald erwärmt (~ 15 min), laden Sie die System-Verifikation Patrone auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test QC. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die notwendigen Maßnahmen zur Qualitätskontrolle durchzuführen. </li><li> Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test Patient. Alle gespeicherten Informationen von der Präparationsinstrument angezeigt. Klicken Sie auf Start, um Abtastung zu initialisieren. Das System wird eine Groborientierung und Kantenerkennung auf der Magnetvorrichtung Patrone durchzuführen. </li><li> Stellen Sie alle Kanten, wie erforderlich, mit den Richtungstasten. Wählen Sie OK. Das System wird eine Feinfokus durchführen und beginnen Abtastung. </li><li> Nach dem Scannen der Kontrollergebnisse sollten anhand der festgelegten Kriterien für die Zellen bei hohen (CK + DA versetzt validiert werdenPI + CD45 - APC +) und niedriger (CK + DAPI + CD45 - FITC +)-Konzentrationen. Nach dem Scannen der Patientenprobe Ergebnisse sollten für aufgenommene CTC CTC über die definierten Kriterien (CK + DAPI + CD45 -) überprüft werden. </li></ol> 2. CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit der CSS- 1. Vorbereitung der benutzerdefinierten Marker und Instrument Initialisierung <ol><li> Verdünnte den Antikörper von Interesse unter Verwendung Bond Primärantikörperverdünnung auf die gewünschte Konzentration in einem Marker Reagenzienbecher unter Verwendung der folgenden Formel, wobei die Arbeitskonzentration ist die Konzentration des Antikörpers nach der Zugabe zu der Probe und der Stoffkonzentration ist die Konzentration des Antikörpers in der Reagenz Tasse. Für mehrere Proben, stellen die Antikörper-Mengen wie in Tabelle 1 beschrieben. Setzen Sie die Markierung Reagenzienbecher in Position 1 in der Reagenzienkartusche und load die Patrone auf CSS. Auf Konzentration = (Arbeits Konzentration x 850 ul) / 150 ul </li><li> Blutentnahme, bereiten Proben, und laden Sie die Vorbereitung Instrument wie in der obigen Aufzählung von Standard-CTC Patient Blutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben. Um benutzerdefinierte Marker zusätzlich zu aktivieren, wählen Sie Benutzerdefiniert Assay, wenn sie von der Vorbereitung Instrument aufgefordert werden. Geben Sie die Markierungsnamen und wählen Sie Speichern. Als Proben werden auf das Gerät geladen, wird der Bediener aufgefordert, anzugeben, welche kundenspezifische Marker mit Ja oder Nein wie nötig erhalten sollten. </li></ol> 2. Beispiel Scannen von benutzerdefinierten Markierungen auf der Analyse-Instrument <ol><li> Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS beschrieben </sTrong&gt; Protokoll. </li><li> Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Um die FITC Kanal initialisieren, wählen Cellsearch CTC als Kit-ID, unter der Rubrik Testprotokolle. Von diesem Menü CTC Forschung, klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten, und stellen Sie die Belichtungszeit nach Wunsch. Es wird empfohlen, eine Belichtungszeit von 1,0 Sekunden bei Verwendung der CSS-CTC-Kit, da dies zu Durchbluten in andere Kanäle für die Fluoreszenz CTC Identifizierung genutzt erhöhen nicht überschritten werden. </li></ol> 3. Anpassung der Standard-CSSProtocol für den Einsatz in präklinischen Mausmodellen ** Aus Veridex Maus / Ratte CellCapture Kit angepasst (nicht mehr im Handel erhältlich) 1. Maus Blutentnahme und Lagerung <ol><li> Vor der Blutentnahme, führen ~ 30 ul 0,5 M EDTA durch eine 22 G-Nadel hin und her, so dass eine kleine Menge von EDTA in der Nabe. </li><li>Sammeln ein Minimum von 50 ul Blut von Mäusen, Maus über orthotopen, Schwanzvene oder intra Routen zuvor mit menschlichen Tumorzellen injiziert. Blutentnahme aus der Vena saphena magna (für serielle CTC-Analyse) oder durch Herzpunktion (für Terminal-CTC-Analyse). Entfernen Sie die Nadel und verzichten Blut in eine 1 ml EDTA Microtainer Blutentnahmeröhrchen. Mischen durch Umdrehen oder sanft Röhrchen klopfen, um Blutgerinnung verhindern. Blut kann sofort für bis zu 48 h nach der Zugabe von einem gleichen Volumen CytoChex Zellkonservierungsverarbeitet oder bei Raumtemperatur gelagert werden. </li></ol> 2. CTC-Anreicherung <ol><li> Entfernen CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie. </li><li> Übertragen das Äquivalent von 50 &amp;mgr; l Vollblut auf eine 12 mm x 75 mm Durchflusszytometrie Rohr. Gib 500 ul Verdünnungspuffer, zu jeder Probe, Abwaschen kein Blut, die auf den Seiten der Röhre verbleibt. Wenn nötig, eine kurze Zentrifugenspinnkann verwendet werden, um alle verbleibenden Blut zu sammeln. </li><li> Vortexen Sie vorsichtig die anti-EpCAM Ferrofluid und fügen Sie 25 ul zu jeder Probe, indem Sie die Spitze der Pipette direkt in die Probe. In 25 ul Capture-Enhancement-Reagenz und Wirbel sanft zu mischen. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Zeigen Probenröhrchen in den Magneten und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen. </li></ol> 3. CTC-Färbung <ol><li> Die Probenröhrchen aus dem Magneten und Resuspension in 50 ul Nucleic Acid Dye 50 ul Färbereagenz, 1,5 ul Anti-Maus-CD45-APC, 5,0 ul Anti-Human-HLA-Alexa Fluor 488, und 100 ul Permeabilisierung entfernen Reagenz. Für mehrere Proben können diese Reagenzien vorgemischt werden und 206,5 ul der Mischung kann zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Vortex vorsichtig mischenund Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> In 500 ul Verdünnungspuffer, Wirbel sanft, Platz Probenröhrchen in den Magneten, und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen. Die Probenröhrchen entfernen aus dem Magneten und resuspendieren in 350 ul Verdünnungspuffer. Vortex vorsichtig mischen. </li></ol> 4. Magnetische Geräte Loading <ol><li> Verwendung eines Gel-Ladespitze sorgfältig das gesamte Volumen aus dem Probenröhrchen übertragen in eine Patrone in der magnetischen Vorrichtung. Beginnen an der Unterseite der Patrone und langsam zurückzuziehen der Spitze, während die Probe abgegeben wird. </li><li> Sobald die gesamte Probe übertragen worden ist, lose Kappe der Magnetvorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken wie in Sectio beschrieben frein 3.1 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS. </li><li> Pop alle Blasen mit einer sterilen 22 G Nadel, indem er sie zwischen der Abschrägung und dem Rand der Patrone. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und Inkubation im Dunkeln für mindestens 10 min. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden. </li></ol> 5. Scannen manuell getrennter Proben auf der Analyse-Instrument <ol><li> Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben. </li><li> Legen Sie die Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Löschen Sie alle vorhandenen Daten auf dem Magnetgerätedaten durch Klicken auf die Schaltfläche Format Probe-Taste. Aktivieren Sie die FITC-Kanal einnd stellen Sie die Belichtungszeit auf 1,0 Sekunden, wie in Abschnitt 2.2 der CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit Hilfe der CSS beschrieben. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Test Patient und wählen Sie Bearbeiten zur Eingabe der Probeninformationen. Wählen Cellsearch CTC als Kit-ID und CTC Forschung als Testprotokoll. Geben Sie die restlichen notwendigen Informationen, wie angegeben, wie der Stern. Speichern Sie die Probe Informationen und klicken Sie auf Start. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

Der Autor (ALA) erhielt Mittel, die von Janssen Onkologie, dessen Mutterunternehmen Johnson &amp; Johnson besitzt auch Janssen Diagnostics LLC, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert wurde bereitgestellt.

Trotz der Entwicklung vieler neuer Technologien CTC seit der Einführung der CSS im Jahr 2004, ist diese Technik immer noch die einzige klinisch bewährte Technologie auf dem Markt, und deshalb wird es als der aktuelle Goldstandard für die CTC-Nachweis und die Zählung. Diese Handschrift hat gezeigt, dass, obwohl die CSS hat strenge Qualitätskontrollen kann es für die Auslegung Bias sein und das CTC-Identifikation in Patientenproben ist in dotierten Proben viel anders als Identifikation. Sechs Kategorien von häufig ...

Im Jahr 2013 wird geschätzt, dass 580.350 Menschen an Krebs sterben und dass 1.660.290 neue Fälle dieser Krankheit wird allein in den USA 1 diagnostiziert werden. Die meisten dieser Todesfälle treten im Anschluß an die Entwicklung von Metastasen 2. Der derzeitige Mangel an wirksamen Therapien in der Behandlung von Metastasen und eine begrenzte Verständnis der metastatischen Kaskade macht dieses Stadium der Erkrankung sehr tödlich. Das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in die Blutbahn wurde gezeigt, dass mit Metastasen 3 korrelieren. Diese Zellen sind extrem selten und ihr Nachweis bei metastasierendem Brust 4, 5 Prostata bezeichnend für das Gesamtüberleben und kolorektalem Krebs 6. Bei diesen Patienten ≥ 5 (Brust-und Prostatakrebs) oder ≥ 3 (kolorektalen) CTC in 7,5 ml Blut ist das Vorhandensein von bezeichnend für schlechtere Prognose im Vergleich zu den Patienten mit weniger oder ohne nachweisbare CTC in der same Blutvolumen. Außerdem wurde die Änderung der Anzahl CTC während oder nach der therapeutischen Intervention nachgewiesen, die als Prädiktor für die Behandlung angesprochen, oft früher als gegenwärtig verwendeten Techniken 7-10 sein. Es wurde geschätzt, dass in metastatischen Krebspatienten, CTC treten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro CTC 10 5 -10 7 mononukleären Blutzellen und bei Patienten mit lokalisierter Erkrankung kann diese Frequenz auch niedriger sein (1 ~ 10 in 8). Die seltene Art dieser Zellen kann es schwierig machen, genau und zuverlässig zu erfassen und zu analysieren, CTC 11. Mehrere Verfahren (vorher 12-14 prüft) verwendet worden, um durch Ausnutzung Eigenschaften, die sie von den umgebenden Blutkomponenten unterscheiden bereichern und erkennen diese Zellen. Im allgemeinen ist CTC Aufzählung ein zweiteiliges Verfahren, das sowohl eine Anreicherungsschritt und einen Erfassungsschritt erfordert. Traditionell verlassen Anreicherungsschritte auf Unterschiede in phys.schen Eigenschaften von CTC (Zellgröße, Dichte, Verformbarkeit) oder Protein-Marker-Expression (dh Epithelial Cell Adhesion Molecule [EpCAM], Cytokeratin [CK]). Nach Anreicherung kann CTC Detektion in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, von denen die häufigsten sind Nukleinsäure-basierte Assays und / oder durchflusszytometrische Ansätze durchgeführt werden. Jede dieser Strategien sind einzigartig, mit unterschiedlichen Vor-und Nachteile, aber sie alle nicht standardisiert, eine Notwendigkeit für den Eintritt in die klinische Einstellung. Das Cellsearch System (CSS) wurde daher entwickelt, um eine standardisierte Methode zum Nachweis und zur Zählung von seltenen CTC in menschlichem Blut unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Antikörper-basierte Techniken 4-6 bereitzustellen. Diese Plattform wird derzeit als der Goldstandard in der CTC-Enumeration und ist der einzige von der US Food and Drug Administration (FDA) für den Einsatz in der Klinik 15 bewährte Technik. Die CSS ist ein Zwei-Komponenten-Plattform consisting, (1) die CellTracks AutoPrep System (nachstehend als Präparationsinstrument bezeichnet), welche die Herstellung von menschlichen Blutproben, und (2) die CellTracks Analyzer II (nachstehend als Analyseinstrument bezeichnet), die diese Scans automatisiert Proben nach der Vorbereitung. Um CTC verunreinigen Leukozyten die Vorbereitung Instrument unterscheiden beschäftigt ein Antikörper vermittelt wird, Ferrofluid-basierten Ansatz, magnetische Trennung und Differenzfluoreszenzfärbung. Zunächst markiert der CTC-System mit Anti-EpCAM-Antikörper gegen Eisen-Nanopartikel konjugiert. Die Probe wird dann in einem Magnetfeld inkubiert und alle unmarkierten Zellen abgesaugt. Ausgewählte Tumorzellen resuspendiert und inkubiert in einem Differenz Fluoreszenz-Färbung, bestehend aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern und eine Kernfärbung Reagenz. Schließlich wird die Probe einem magnetischen Kassette übertragen, genannt magnest (nachfolgend als Magneteinrichtung bezeichnet) und scanned mit dem Analyseinstrument. Das Analysegerät wird verwendet, um mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Filter, die jeweils mit der geeigneten Fluoreszenzpartikel optimiert, mit einem 10x-Objektiv vorbereiteten Proben scannen. CTCs als Zellen, die durch Anti-EpCAM-, Anti-Pan-CK-Phycoerythrin (PE) gebunden sind (CK8, 18 und 19) und die Kernfärbung 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert. Umgekehrt werden die kontaminierenden Leukozyten Zellen, die durch Anti-CD45-Allophycocyanin (APC) und DAPI gebunden werden identifiziert. Nach dem Abtasten werden Computer-definierten potentiellen Tumorzellen, die dem Benutzer präsentiert. Aus diesen Bildern, muss der Benutzer die qualitative Analyse zu verwenden mit den definierten Parametern und Differenzialfärbungs oben erörtert, um zu bestimmen, welche Ereignisse CTC. Zusätzlich zur Bereitstellung einer standardisierten Methode zur CTC Aufzählung ermöglicht molekulare Charakterisierung von CTCs bezogen auf Protein-Marker von Interesse der CSS. Diese Abfrage cauf Einzelzellebene eine durchgeführt werden, wobei ein Fluorescein (FITC) Fluoreszenzkanal nicht für CTC Identifikations 16 erforderlich. Obwohl diese Plattform bietet die Fähigkeit zur molekularen Charakterisierung, der detaillierte Prozess der Entwicklung von Protokollen und Optimierung nicht gut definiert. Drei kommerziell erhältlichen Markern wurden vom Hersteller zur Verwendung mit der CSS, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) entwickelt. HER2-Analyse, in Kombination mit der CSS, wurde von mehreren Gruppen genutzt werden, um das Potenzial für CTC Charakterisierung veranschaulichen, um die klinische Entscheidungsfindung zu informieren und eventuell vorhandenen Behandlungsrichtlinien zu ändern. Zum Beispiel Fehm et al. Zeigten, dass 17 etwa ein Drittel der Brustkrebs-Patientinnen mit HER2-Primärtumoren hatten HER2 + CTC. Zusätzlich Liu et al.18 vor kurzem berichtet, dass bis zu 50% der Patienten mit HER + metastasierendem Brustkrebs nicht haben HER2 + CTC. Herceptin, ein HER2-Rezeptor stören monoklonalen Antikörper nachgewiesen, dass Patienten, deren Tumore HER2 ausreichend, ist ein häufig genutzt Behandlung für Patienten mit HER2 + Primärtumoren 19-21 stark profitieren. Allerdings deuten diese Studien, dass Herceptin kann als Sub-optimal genutzt und das CTC Charakterisierung kann bei der Vorhersage Ansprechen auf die Behandlung zu unterstützen. Letztlich kann CTC Charakterisierung haben das Potenzial, individuelle Betreuung zu verbessern. CTC Forschung ist einzigartig, es ist weitgehend eine Nacht-zu-Tisch-Ansatz verwendet. Diese Methode, die im Gegensatz zu Tisch-zu-Bett Forschung, die oft Jahre kann die Patientenversorgung auswirken, hat CTC schnellen Einstieg in die klinischen Einstellung erlaubt. Allerdings sind Ärzte zögern, die Ergebnisse von CTC-Analyse in der Patientenbehandlung Entscheidungs ​​mak verwendenten durch einen Mangel an Verständnis der zugrunde liegenden Biologie. Daher geeigneten präklinischen Mausmodellen der Metastasierung und komplementäre Analysetechniken CTC müssen, um diese offenen Fragen untersuchen genutzt werden. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Tiermodellen verwendet werden, um die metastatischen Kaskade untersuchen: (1) spontane Metastasierung Modelle, die für die Untersuchung aller Schritte in der metastatischen Kaskade zu ermöglichen, und (2) experimentelle Metastasierung Modellen, die nur ermöglichen, das Studium der späteren Schritte in der metastatischen Prozess wie Extravasation und sekundären Tumorbildung 22. Spontane Metastasierung Modelle beinhalten Tumorzellinjektionen in geeignete orthotopen Stellen (zB Injektion von Prostata-Krebszellen in der Prostata für die Untersuchung von Prostatakrebs). Die Zellen werden dann Zeit, um Primärtumoren bilden und spontan auf sekundären Standorten wie der Knochen, Lunge und Lymphknoten metastasieren gegeben. InDagegen experimentellen Metastasierung Modelle direkte Injektion von Tumorzellen in die Blutbahn (z. B. über Schwanzvene oder intrakardiale Injektion, um Zellen gezielt an bestimmte Stellen) und damit die ersten Schritte Intravasation und Verbreitung zum sekundären Organe 22. So weit die Mehrheit der CTC-Analyse in in vivo Modellsystemen durchgeführt wurde entweder mit Durchflusszytometrie-basierte 23 oder angepasst menschlichen CTC-basierte Techniken (zB AdnaTest) 24. Obwohl nützlich, keine dieser Techniken angemessen widerspiegeln CTC Aufzählung mit dem Gold-Standard CSS. Bezogen auf die klinische Zulassung standardisierte Art und weit verbreiteten Nutzung des CSS wäre die Entwicklung eines CTC Fänger-und Nachweisverfahren für die in vivo-Modellierung, die äquivalent der Probenvorbereitung, die Verarbeitung verwendet, und Identifizierungskriterien vorteilhaft als Ergebnis wäre vergleichbar mit denen aus Patientenproben erhalten. Jedoch aufgrund der Volumen requirements des Präparationsinstruments ist es nicht möglich, kleine Mengen an Blut mit diesen automatisierten Plattform verarbeitet. . Außerdem früheren Arbeit von Eliane et al 25 hat gezeigt, dass eine Kontamination der Proben mit der Maus Epithelzellen (die auch die Standard-CTC Definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -] erfüllen) kann zu Fehlklassifikation von Maus Plattenepithel Epithelzellen führen CTC. Um diese Probleme anzugehen eine angepasste Technik, die die Nutzung der CSS-CTC-Kit-Reagenzien in Kombination mit einem manuellen Isolationsverfahren wurde entwickelt, ermöglicht. Die Zugabe eines FITC-markierten humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Antikörpers zu dem Assay ermöglicht menschlichen Tumorzellen aus Maus Plattenepithelzellen unterscheiden. Dieses Manuskript beschreibt die Standard-, kommerziell entwickelte und optimierte CSS-Protokoll für die Verarbeitung von Patientenblutproben und Fallstricke, die auftreten können, einschließlich Abweit Elemente, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann. Zusätzlich Anpassung der CSS-Test, benutzerdefinierte Proteineigenschaften von CTC erfasst und vergleichbarer angepasst CSS-Technik, die für die Anreicherung und den Nachweis von CTC von kleinen Blutvolumina in präklinischen Mausmodellen von Metastasen ermöglicht untersuchen beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

Die Mehrheit der durch Krebs verursachten Todesfälle treten im Anschluss an die Entwicklung von Metastasen. Diese hoch tödliche Krankheit Stufe mit dem Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) zugeordnet ist. Diese seltenen Zellen wurde gezeigt, dass der klinische Bedeutung bei metastasierendem Brust-, Prostata-, und Darmkrebs sein. Der aktuelle Gold-Standard in der klinischen CTC Nachweis und die Zählung ist die FDA-Zulassung Cellsearch System (CSS). Dieses Manuskript beschreibt die Standard-Protokoll, das von dieser Plattform genutzt sowie zwei zusätzliche angepasste Protokolle, die den detaillierten Prozess von benutzerdefinierten Marker-Optimierung für die Protein-Charakterisierung von Patienten CTC und einem vergleichbaren Protokoll für CTC Erfassung in sehr geringen Mengen an Blut zu beschreiben, mit Standard- CSS Reagenzien zur Untersuchung von in vivo präklinischen Mausmodellen der Metastasierung. Darüber hinaus Unterschiede in der Qualität zwischen CTC gesunden Spenderblut, versetzt mit Zellen aus Gewebekultur gegenüber Patienten Blut samples werden hervorgehoben. Schließlich werden mehrere häufig abweichende Positionen, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann skizziert. Zusammengenommen werden diese Protokolle eine nützliche Ressource für die Nutzer dieser Plattform interessiert in der präklinischen und klinischen Forschung im Zusammenhang mit der Metastasierung und CTC werden.

Standard-CTC Enumeration Assay Die Empfindlichkeit und Spezifität des CSS wurde in der Literatur gut dokumentiert. Allerdings gleichwertige CTC Erholung bestätigen, Stachel (1.000 LNCaP menschlichen Prostata-Krebszellen) und undotierten menschlichen Blutproben von gesunden freiwilligen Spendern wurden auf der CSS mit dem Standard-Protokoll CSSCTC verarbeitet. Wie erwartet, waren undotierten Proben frei von CTC, 0,00 ± 0,00% und CTC Erholung wurde gezeigt, dass 86,9 ± 4,71% für die dotierte...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K Aufrufe.  London Health Sciences Centre.  Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben. 

Serie: Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Forschung

Medizin

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gentransfer-Technik und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

Proton Therapy Lieferung und ihre klinische Anwendung in ausgewählten soliden Tumoren Malignome

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Eine In Vivo -Methode zur Bewertung der Darm-Blut-Schranke und LEBERSTOFFWECHSEL Mikrobiota Produkte

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...