Kleine Signalmoleküle zielen auf verschiedene Effektorproteine ab, um die bakterielle Virulenz und die menschliche Biologie zu kontrollieren. Diese Effektorproteine sind jedoch schwierig zu identifizieren. Als systembiologisches Werkzeug ermöglicht DRaCALA eine praktikable, schnelle und hochempfindliche Identifizierung der unbekannten Effektorproteine unter Verwendung einer OVium-Bibliothek.
DRaCALA könnte verwendet werden, um jedes kleine Signalmolekül zu untersuchen, solange es entweder mit radioaktiven Isotopen oder fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden kann. Beginnen Sie mit der Impfung von E.coli in 1,5 Milliliter LB, ergänzt mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol in jeder Vertiefung von 96-Well-Tiefbrunnenplatten für eine Nachtinkubation bei 30 Grad Celsius und 160 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Morgen die Nachtkulturen sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 500 mikromolaren IPTG behandeln, um die Proteinexpression zu induzieren.
Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation pelletieren, den Überstand entfernen und die Proben bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Lyse einzuleiten, resuspendieren Sie die Pellets in 150 Mikroliter Lysepuffer pro Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auftauen. Das Lysat sollte dann vor Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.
Um die Lyse von Zellen mit überexprimierten Proteinen abzuschließen, resuspendieren Sie die Proben in 40 Milliliter eiskaltem Lysepuffer zwei und beschallen Sie die Proben mit einer Amplitude von 60% bei zwei Sekunden auf vier Sekunden für acht Minuten, dann löschen Sie die Lysate durch Zentrifugation. Während die Proben zentrifugiert werden, fügen Sie 500 Mikroliter homogenisiertes Nickel-NTA-Harz zu einer stehenden Polypropylenchromatographiesäule hinzu. Nach 15 Minuten das abgesetzte Harz zweimal mit 15 Millilitern Reinstwasser und einmal mit 15 Millilitern Lysepuffer zwei waschen.
Am Ende der Zentrifugation den geklärten Lysatüberstand auf die Säule laden. Wenn das gesamte Lysat durch die Säule geflossen ist, waschen Sie die Säule mit 30 Millilitern Waschpuffer. Um die Proteine zu eluieren, fügen Sie 400 Mikroliter Volumen Elutionspuffer in die Säule und wiederholen Sie die Elution dreimal.
Weitere 300 Mikroliter Volumen des Elutionspuffers, um die Elution dreimal zu wiederholen und die eluierten Proteine in einem Endvolumen von 700 Mikrolitern zu kombinieren. Für die Gelfiltration der eluierten Probe laden Sie nach dem Waschen einer Größenausschlusssäule mit 25 Millilitern frisch zubereitetem Gelfiltrationspuffer das gesamte Volumen des eluierten Proteins mit einer 500-Mikroliter-Schleife auf die Säule. Laufen Sie mit 500 Mikrolitern pro Minute und sammeln Sie zwei bis drei 500 Mikroliter Volumenfraktionen der jeweiligen Proteine.
Verwenden Sie dann einzelne Spinsäulen, um jedes Protein zu konzentrieren, und verwenden Sie das Bradford-Assay-Kit, um die Proteinkonzentrationen gemäß standardisierten Protokollen zu messen. Um das phosphor-32-markierte Guanosinpentaphosphat zu synthetisieren, bauen Sie eine kleine Relseq-Reaktion in einem schraubbedeckten Rohr zusammen, wie in der Tabelle beschrieben, und inkubieren Sie die Reaktion in einem ThermoMixer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von fünf Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubationen das ausgefällte Protein durch Zentrifugation herunterspinnen und das synthetisierte Phosphor 32 markierte Guanosinpentaphosphat, das Überstand enthält, in ein neues schraubbedecktes Röhrchen übertragen.
Für die Phosphor-32-Guanosintetraphosphatsynthese fügen Sie der Hälfte des phosphor-32-markierten Guanosinpentaphosphatprodukts in einem neuen schraubbedeckten Röhrchen ein mikromolares GppA hinzu und inkubieren sie die Reaktion für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, fünf Minuten bei 95 Grad Celsius und fünf Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation den Niederschlag durch Zentrifugation herunterspinnen und das phosphor-32-markierte Guanosintetraphosphat, das überstandshaltig enthält, in ein neues Röhrchen übertragen. Um die isolierten Zielproteine zu analysieren, führen Sie einen Mikroliter jeder Probe auf einer Dünnschichtchromatographieplatte mit 1,5 molarem Monokaliumphosphat als mobile Phase aus.
Legen Sie nach der Analyse die getrocknete Platte in eine transparente Kunststoffmappe und setzen Sie die Platte fünf Minuten lang einem Speicherphosphorsb aus, bevor Sie die Daten auf einem Phosphor-Imager visualisieren und quantifizieren. Für das DRaCALA-Screening der Zielproteine werden 20 Mikroliter der aufgetauten Großhandelslysate zu einzelnen Vertiefungen einer 95-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte hinzugefügt und 2,5 Einheiten Serratia marcescens Endonuklease zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius die Lysate für 20 Minuten auf Eis legen.
Als nächstes mischen Sie gleiche Mengen phosphor 32 markiertes Guanosinpentaphosphat und Guanosintetraphosphat und fügen Sie 1X Lysepuffer eins zu der Mischung hinzu, um eine vier nanomolare Guanosinpentaphosphatlösung zu erhalten. Mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette und gefilterten Pipettenspitzen 10 Mikroliter der Guanosinpentaphosphatmischung mit dem Zelllysat für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation waschen Sie ein 96X-Pin-Werkzeug dreimal in einer 0,01% igen Lösung von nichtionischem Reinigungsmittel für 30 Sekunden, gefolgt von 30 Sekunden Trocknen auf einem Papiertuch pro Waschgang, bevor Sie das Pin-Werkzeug in die 96-Well-Probenplatte legen.
Heben Sie das Stiftwerkzeug nach 30 Sekunden gerade nach oben und legen Sie es für 30 Sekunden gerade auf eine Nitrocellulosemembran. Nach fünf Minuten Trocknung legen Sie die Nitrocellulosemembran in eine transparente Kunststoffmappe zur Speicherung von Phosphor und zur Visualisierung durch Phosphorbildgebung, wie gezeigt. Um potenzielle Zielproteine zu quantifizieren und zu identifizieren, öffnen Sie in der Analysesoftware, die mit dem Phosphor-Imager verbunden ist, die Geldatei der visualisierten Platten.
Um die zu analysierenden Punkte zu definieren, verwenden Sie die Array-Analysefunktion, um ein 12-spaltend mit acht Zeilen einzurichten. Um den äußeren Rand der Lochpunkte einzukreisen, definieren Sie große Kreise, exportieren Sie das Volumen plus Hintergrund und Fläche der definierten großen Kreise in eine Tabelle. Um die kleinen inneren Punkte einzuschließen, verkleinern Sie die definierten Kreise, exportieren Sie das Volumen plus Hintergrund und Fläche der definierten kleinen Kreise und speichern Sie alle Daten in der Tabelle.
Positionieren Sie Kreise so, dass sie sich bei Bedarf mit Punkten überlappen, und erhöhen Sie die Größe der etwas größeren als die tatsächlichen Flecken. Verwenden Sie die Gleichung, um die Bindungsbrüche in der Tabelle zu berechnen und die Daten zu plotten. Identifizieren Sie dann die potenziellen Bindungsproteine in den Vertiefungen, die im Vergleich zu den meisten anderen Vertiefungen hohe Bindungsfraktionen aufweisen.
Bei dieser repräsentativen Analyse kann in den meisten Vertiefungen eine Platte mit relativ geringen Hintergrundbindungssignalen beobachtet werden. Das positive Bindungssignal in Bohrung H3 zeigte eine Bindungsfraktion, die aufgrund der Überexpression des Guanosinpentaphosphat-bindenden Proteins Hpt viel höher war als bei den anderen Vertiefungen. In den repräsentativen Platten zeigten mehrere Vertiefungen ein relativ höheres Hintergrundbindungssignal, wie die relativ starken inneren Punkte, die in vielen Vertiefungen beobachtet wurden, sowie die nach der Quantifizierung beobachteten konstant hohen Bindungsfraktionen zeigen.
Bemerkenswerterweise ergaben einige Ziele auch variable Bindungsbrüche, wie z. B. die falsch positiven Ergebnisse. Zur weiteren Klärung verwendeten die Forscher gereinigte Proteine, um die Bindung erneut zu testen. Sobald die Zielproteine identifiziert sind, kann man sie auf Homogenität reinigen und Die Interaktionsstärke und -spezifität bestätigen, indem man entweder DRaCALA, isotherme Titrationskalorimetrie oder andere Methoden verwendet.
Die Identifizierung der Zielproteine kleiner Signalmoleküle ebnet den Weg zu einem tiefen Verständnis der Rollen, die sich von der bakteriellen Virulenz bis zur menschlichen Biologie ergeben.
