Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie ist eine auf einer Laserpinzette basierende Einzelmolekültechnik, die es ermöglicht, die Chemomechanik von Myosinmotoren unter Last mit höchster zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es, sehr schnelle Ereignisse in der Krafterzeugung zu untersuchen, indem die Kraft in jeder Phase der Motorinteraktion konstant gehalten wird, wobei die Kraftrichtung vollständig kontrolliert wird. Durch entsprechende Anpassungen könnte dieses Protokoll leicht auf andere Arten von Prozessmotoren, einschließlich Kinesine und Dynine, angewendet werden, um die Regulierung durch Gewalt aufzudecken.
Nachdem Sie einen Satz akusto-optischer Deflektoren an einem linearen Übersetzer montiert haben, nehmen Sie eine Blende und passen Sie ihre Blende an die Größe der Objektivrückblende an. Ersetzen Sie das Objektiv durch die Blende, die auf dem Objektivgehäuse mit Gewinde zentriert ist. Bewegen Sie den Übersetzer in Richtung des Laserstrahls, bis der vom Piezokristall blockierte Teil des Strahls nach der Blende sichtbar ist, und drehen Sie den Übersetzer leicht nach hinten, bis der Strahl die Blendenöffnung vollständig ausfüllt.
Um Kieselsäurekügelchen in Pentylacetat herzustellen, verdünnen Sie zunächst 20 Mikroliter 1,2 μm 10% feste Kieselsäurekügelchen in 1-1,5 Milliliter Aceton mit Vortexing und 30 Sekunden Beschallung. Nach der Beschallung werden die Kügelchen durch Zentrifugation gesammelt und das Perlenpellet für eine zweite Wäsche in 1 Milliliter frischem Aceton resuspendiert. Nach der zweiten Acetonwäsche werden die Perlen dreimal in 1 Milliliter frischem Pentylacetat pro Waschgang unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen gewaschen und das Pellet in 100 Mikrolitern 1% Nitrocellulose und 900 Mikroliter Pentylacetat resuspendiert.
Als nächstes wischen Sie mit einem reinen Ethanol-getränkten Stück Laborgewebe ein 24 x 24 Millimeter großes Glasdeckglas vorsichtig ab, bevor Sie mit einer sauberen Pinzette das Glas direkt im Ethanol spülen und das Deckglas unter sanftem Stickstofffluss trocknen lassen. Wirbeln und beschallen Sie das vorbereitete Silica-Kügelchenmaterial für 30 Sekunden und verwenden Sie ein mit Ethanol gereinigtes 24 x 60 Millimeter Deckglas, um 2 Mikroliter Silica-Kügelchenlösung auf die Oberfläche des kleineren Deckglases zu schmieren. Während die Perlen trocknen, reinigen Sie einen 26 x 76 Millimeter großen Objektträger wie gezeigt und legen Sie zwei 60-100 Mikrometer dicke Linien von 3 Millimetern doppelseitig auf die langen Kanten des Objektträgers.
Legen Sie das perlenbeschichtete Deckglas mit einer sauberen Pinzette auf das Klebeband mit den Perlen auf der Innenseite der Objektträgerkammer und füllen Sie die Kammer mit 15 Millimolarphosphatpuffer und schwimmender Polystyrolperlenlösung. Dann verschließen Sie die Kammer mit Silikonfett. Um das Pixel-zu-Nanometer-Verhältnis der Hellfeldkamera zu kalibrieren, nehmen Sie ein erstes Bild einer Siliziumdioxidperle auf der Deckglasoberfläche etwa 5 Mikrometer von der Mitte des Sichtfeldes entfernt auf.
Bewegen Sie die Bühne, um die Perle um 10 Mikrometer in Richtung der Mitte des Sichtfeldes zu verschieben, und nehmen Sie ein zweites Bild auf. Berechnen Sie die Kamerakalibrierungskonstante, indem Sie den Pixelabstand zwischen zwei Positionen der Perle messen. Um die Position der Falle zu kalibrieren, fangen Sie ein einzelnes schwimmendes Partikel in einer Falle ein und bewegen Sie die akusto-optischen Deflektoren in Schritten von 0,2 Megahertz, wobei Sie ein Bild des Partikels und die entsprechende Frequenz der Deflektoren für jeden Schritt aufnehmen.
Wiederholen Sie dann die Kalibrierung für die zweite Falle auf die gleiche Weise. Um die Leistung und Steifigkeit der Falle zu kalibrieren, fangen Sie ein einzelnes Partikel in jeder Falle ein und verschieben Sie beide Fallen mit den akusto-optischen Deflektoren in 0,2-Megahertz-Schritten, wobei eine Brownsche Bewegung des Partikels in beiden Fallen mit Quadrant-Photodiodendetektoren und die entsprechende Frequenz der akusto-optischen Deflektoren aufgezeichnet wird. Kalibrierungskonstanten erhalten, indem man eine Lorentzsche Funktion an ein Leistungsspektrum der aufgezeichneten Brownschen Bewegung anpasst.
Um eine Probe für die Messung zusammenzustellen, geben Sie 1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertes BSA in eine neue Kammer mit Kieselsäurekügelchen auf der Deckglasoberfläche. Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer mit AB-Puffer und geben Sie 1 Milligramm pro Milliliter Streptavidin in die Kammer. Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer wie gezeigt und fügen Sie 3 nanomolare biotinylierte Myosin-5B schweres Meromyosin in M5B-Puffer hinzu, der mit 2 mikromolaren Calmodulin ergänzt ist.
Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer dreimal mit 1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem BSA, ergänzt mit 2 mikromolaren Calmodulin in AB-Puffer, und warten Sie 3 Minuten nach der letzten Wäsche. Das Reaktionsgemisch wird fließen lassen und die Kammer mit Silikonfett versiegelt. Um die Probe zu messen, legen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie das Objektiv, bis die schwebenden Alpha-Aktinin-Kügelchen scharf sind.
Schalten Sie eine Falle ein und fangen Sie eine Perle ein. Sobald die erste Überfüllung besetzt ist, bewegen Sie den Übersetzer, um die gefangene Perle in der Nähe der Deckglasoberfläche zu positionieren, um zu vermeiden, dass mehrere Perlen eingefangen werden, und fangen Sie eine Perle in der zweiten Überfüllung ab. Verschieben Sie die Probe durch die Langstrecken-Übersetzer, um Aktinfilamente von mindestens 5 Mikrometern Länge in der Lösung zu lokalisieren.
Wenn ein Filament entdeckt wurde, bewegen Sie die Probe so, dass sich eine gefangene Perle einem Ende des Filaments nähert. Sobald das Filament angebracht ist, passen Sie den Abstand der Perle an die ungefähre Filamentlänge an und bewegen Sie den Tisch, um einen Fluss in der ungebundenen Raupenrichtung zu erzeugen. Das Filament wird durch die Strömung gedehnt und bindet sich schließlich an die zweite Perle.
Der resultierende Komplex wird als Hantel bezeichnet"Um einen Aktin-Myosin-Kontakt herzustellen, trennen Sie die beiden Fallen vorsichtig und stellen Sie das Filament auf Vorspannungen von bis zu etwa 3 Pikonewton ein. Um die Steifigkeit der Hantel zu untersuchen, lassen Sie eine Falle in einer dreieckigen Welle oszillieren, indem Sie die Frequenz eines akusto-optischen Deflektors ändern und die daraus resultierende Übertragung der Bewegung auf die nachfolgende Perle durch ihr Positionssignal überprüfen. Bewegen Sie die Bühne, um die Hantel in der Nähe einer Sockelkieselsäureperle zu positionieren, und stellen Sie die Höhe der Hantel so ein, dass das Aktinfilament mit der Kieselsäureperlenoberfläche in Kontakt kommt.
Wie in dieser repräsentativen Positionsaufzeichnung beobachtet, bewegen sich die gefangenen Kügelchen mit einer konstanten Geschwindigkeit gegen die viskose Widerstandskraft der Lösung, wenn der Myosinmotor nicht mit dem Aktinfilament interagiert. Sobald der Myosinmotor mit dem Filament zu interagieren beginnt, wird die Kraft, die von dem sich bewegenden Filament getragen wird, sehr schnell auf das Protein übertragen, und die Systemgeschwindigkeit sinkt auf Null, wobei die Schrittereignisse bis zum Ende des Laufs unter konstanter Kraft auftreten. Die Kraft wird von der positiven in die negative Richtung durch das Feedback-System umgeschaltet, das die Kraftrichtung umschaltet, wenn die Perle den Rand des vom Benutzer eingestellten Schwingungsbereichs erreicht.
Wenn das Myosin das Filament in die positive Richtung bindet und verdrängt, drückt es die Perle in Richtung des oberen Randes des Schwingungsbereichs. Wenn dies unter Hilfskraft geschieht, wird der Lauf des Myosins durch die Kraftrichtungsumkehr an der Schwingungskante unterbrochen, wodurch die Länge des Laufs auf die Amplitude der Hantelschwingung begrenzt wird. Eine präzise Ausrichtung des optischen Systems ist notwendig, um die optimale räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen, während eine genaue Kalibrierung notwendig ist, um die Werte der einwirkenden Kräfte genau zu bestimmen.
Diese Technik wurde angepasst, um die gleitende und gezielte Suche nach Transkriptionsfaktoren in DNA sowie dynamische Wechselwirkungen zwischen Mechanotransduktionsproteinen, die über Mikrotubulifilamente induzieren, zu untersuchen.
