Wir danken Gijs wuite, Erwin JG Peterman, und Peter Gross für die Hilfe bei der Mikrofluidik und Alessia Tempestini für die Hilfe bei der Probenvorbereitung. Diese Forschung wurde von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung finanziert n ° 284464 und des italienischen Ministeriums für Bildung, Universität und Forschung FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, und im Rahmen der das Vorzeigeprojekt NANOMAX.

1. Optische Pinzetten-Setup mit Nanometer-Stabilität Der Versuchsaufbau muss zwei optische Pinzette mit Richtungsstabilität im Nanometerbereich und Intensitätsschwankungen der Fanglaser unter 1% bieten. Kombination dieser Bedingungen wird Nanometer Stabilität der Hantel unter typischen Spannung versichern (1 pN - einige zehn PN), Trap Steifigkeit (0,1 pN / nm) und Messbandbreite (Bildaufnahmerate 20 s -1). Ein Schema der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Optische Pinzetten Design und Konstruktion 15,17: <ol><li> Montieren Sie die Versuchsapparatur auf einem optischen Tisch mit aktiven Isolatoren, um mechanische Schwingungen zu reduzieren. Montieren Sie das Mikroskop Struktur auf Elastomerisolatoren, um akustische Störungen und mechanischen Resonanzen des Mikroskops Struktur absorbieren. </li><li> Legen eines optischen Isolators in der Bahn des Fanglaser, in der Nähe der Laserquelle, um Reduce zufällige Amplitudenschwankungen durch optische Rückmeldung. </li><li> Reduzieren Sie die Pfadlänge der Fanglaser so viel wie möglich und legen Sie den gesamten Pfad in einem verschlossenen Kästchen, um Laser-Zeigeschwankungen durch Luftströmungen und Turbulenzen zu reduzieren. </li><li> Doppel erstellen optische Pinzetten, indem ein einzelner Nahinfrarot-Laserquelle (Nd: YAG-Laser, 1064 nm) in zwei Strahlen mit orthogonalen Polarisationen. Verwenden Sie keine Zeit-Shared-Fallen, weil sie dazu führen, Schwingung der Hantel unter Spannung 12. </li><li> Verwenden Sie akustisch-optische Deflektoren (AODs) durch Direct Digital Synthesizer (DDS) angetrieben, feine Bewegungen von (mindestens) eine Falle und präzise Regulierung der DNA-Spannung zu ermöglichen. DDSs ermöglichen eine bessere Stabilität als Falle spannungsgesteuerte Oszillatoren (VCOs). </li><li> Legen Sie zwei Quadrantendetektor Photodioden (QDPs) in der hinteren Brennebene des Kondensators, um die Position der eingefangenen Perlen mit Sub-nm-Genauigkeit zu erfassen. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie diese Intensität fluctuations der Fanglaser am Mikroskop Eingang unter 1% unter Verwendung einer Photodiode mit einer Bandbreite größer als die Geschwindigkeit der Bildaufnahme. </li><li> Überprüfen Sie zeigt Stabilität der beiden Fanglaser: <ol><li> Vorbereitung Silicakügelchen in Phosphatpuffer: 20 ul Silicakügelchen (1,54 um, 10% Feststoffe) in 1 ml Aceton 30 s beschallt, kurz vortexen und zentrifugieren 2 min bei 19.000 x g. Resuspendieren in 1 ml Aceton und das Waschen wiederholen. Resuspendieren in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer, Wasch 2 Mal und schließlich in 100 ul 50 mM Phosphatpuffer resuspendieren. </li><li> Kalibrieren optische Pinzette mit Silica-Perlen: Vorbereitung einer Durchflusszelle, indem ein Deckglas auf einen Objektträger mit doppelseitigem Klebeband (etwa 60 um dick). Fließen 1 mg / ml BSA und 3 min warten. Fließen Siliciumdioxidperlen verdünnt 1/1000 in Phosphatpuffer und die Flusskammer mit Silikonfett zu versiegeln. Falle eine Perle in jedem Falle und kalibrieren die Fallen mit dem Leistungsspektrum Verfahren 18. </li&gt; <li> Vorbereitung Silicakügelchen in Pentyl und Nitrozellulose: Verdünnen von 20 ul Silicakügelchen (1,54 um, 10% Feststoffe) in 1 ml Aceton 30 s beschallt, kurz vortexen und zentrifugieren 2 min bei 19.000 x g. Resuspendieren in 1 ml Aceton und das Waschen wiederholen. Resuspendieren in 1 ml Pentylacetat und wäscht 2 mal. Schließlich resuspendieren sie in Pentylacetat mit 0,1% Nitrocellulose in Pentylacetat aufgelöst. </li><li> Verbreiten 2 ul von 1,54 um Durchmesser in Pentylacetat + 0,1% Nitrocellulose gelöst, auf der Oberfläche eines Deckglases (24 x 24 mm) Silicakügelchen mit einem zweiten Deckglas (24 x 60 mm). Befestigen des Deckplättchens auf einem Objektträger unter Verwendung von zwei Stücken von doppelseitigem Klebeband auf eine Durchflusszelle zu erstellen. Füllen Sie die Durchflusszelle mit 50 mM Phosphatpuffer und verschließen Sie diese mit Silikonfett. </li><li> Bild einer Kieselsäure Wulst in Hellfeldmikroskopie bei 2,000X Vergrößerung. Das Sichtfeld ist 7 x 5 um bei 768 x 576 Pixel erfasst, so dass der Wulst Bild hat einen Durchmesser von 190 pixels. Kompensieren thermische Driften mit einem Feedback-Software, die, wie in der ref. 17, berechnet xy-Position von der Bildschwerpunkt und Z aus der Beugungsringe und korrigiert Abweichungen Bewegung eines Piezo-Bühne mit nm-Genauigkeit oder besser. </li><li> Überlappen die Mitte links-Falle mit dem Wulst Zentrum (die xy-Signalpegel von der QDP muss gleich bei der Kalibrierung gemessen werden können) und messen die Position Lärm und seine Standardabweichung von der QDP. Wiederholen Sie die Messung für die richtige Falle. </li></ol></li></ol> 2. Single Molecule Lokalisierung mit Nanometer-Genauigkeit <ol><li> Fluoreszenzmikroskopie Design und Konstruktion 15,19 <ol><li> Verwenden Sie eine hohe Quanteneffizienz und elektronen multipliziert CCD, um die hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse für Nanometer-Lokalisierungsgenauigkeit erforderlich zu erreichen. </li><li> Wählen Optik ein Bild Pixelgröße ~ 80 nm erhalten (beispielsweise eine Bildvergrßerung ~ 200X mit einem Kamerapixelgröße von 16 um). Dies ist ausreihinreichend kleine bis Lokalisationsfehler aufgrund Pixelation 8 vernachlässigt, aber groß genug, um eine erhebliche Anzahl von Photonen pro Pixel zu sammeln. </li><li> Als Anregungsquelle, Laserlicht, das unpolarisiert ist (indem sie durch eine nicht-polarisationserhaltende optische Faser) oder zirkular polarisiert (Durchleiten durch eine λ / 4 Verzögerungsplatte) der Anregung der einzelnen Chromophore zu maximieren, und zwar unabhängig von ihrer Ausrichtung. </li><li> Wählen Emissionsbandpassfiltern, die effizient abgeschnitten beide Anregung und Trapping Laser-Licht. Hinweis: In unseren Experimenten haben wir unsere Protein markiert mit Atto532 Farbstoff und verwendet ein Bandpassemissionsfilter bei 600 nm mit 100 nm Bandbreite zentriert. </li></ol></li></ol> 3. Mikrofluidik Um eine genaue Kontrolle der Pufferaustausch und &quot;Hantel&quot; Montage, dh die Verankerung eines einzigen DNA-Molekül zwischen zwei optisch gefangenen Mikrosphären, ein custom-built laminaren Mehrkanalströmung zu erreichenSystem entwickelt werden. Dies wird durch eine Durchflusskammer, einem Druckbehälter und einem Druckregelsystem (Figur 2) zusammengesetzt ist. <ol><li> Durchflusszelle Vorbereitung HINWEIS: Die Flusskammer für Einzelmolekül-Experimente an Protein-DNA-Interaktion verwendet wird, hat vorzugsweise 4 Eingänge und 1 Steckdose, bis zu 4 parallel Pufferströme ermöglichen bis, jeder mit einem der verschiedenen Komponenten für das Experiment benötigt: Perlen, DNA, fluoreszenzmarkierte Protein und Abbildungspuffer. Trennung der Komponenten in den Strömungskanälen ermöglicht eine effiziente Montage der Hantel. Außerdem ist die Bilderzeugungskanal nützlich, den Hintergrund zu diffundieren Proteine ​​zu vermeiden und erreichen das hohe Signal-Rausch-Verhältnis für die Lokalisierung des DNA-bindenden Proteins mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von einigen Nanometern erforderlich. <ol><li> Bohrer 1 mm Durchmesser Löcher in der Mikroskop-Objektträger (76 x 76 x 1 mm) mit einer Diamantspitze, um 4 Eingängen und einem Ausgang zu erzeugen. </li><li> Sauber thE Objektträger mit Ethanol und zentrieren den Hafen mit dem O-Ring eingelegt und die Haftring in der Rutsche rund um die Zugangslöcher. Es ist von grundlegender Bedeutung für Handschuhe bei diesem Schritt tragen, um Fingerabdrücke, die den Prozess stören würde Verkleben zu vermeiden. </li><li> Klemmen Sie die Nanoports auf den Schlitten, und legen Sie sie in den Ofen bei 180 ° C für 1 Stunde vorgeheizt, um eine vollständige Befestigung ermöglichen. </li><li> Die Kontur Muster der Strömungszelle auf einem Stück Papier. Die Kanäle sollten ~ 3 mm breit sein und passen Sie die Löcher Position auf dem Objektträger. </li><li> Legen Sie die Zeichnung auf der Oberseite zwei Stücke von Parafilm und mit einem Skalpell scharf machen und kontinuierliche Schnitte entlang der gezeichneten Kontur. Entfernen Sie alle Ausstülpung gebildet. Entsorgen Sie die untere Schicht Parafilm, der nur verwendet wird, um eine saubere Unterstützung zu garantieren. </li><li> Legen Sie die Objektträger mit den beigefügten Nanoports auf den Kopf in den metallischen Träger. </li><li> Sorgfältig ausrichten Parafilm Kammer Umriss mit den Löchern, um sicherzustellen, than der Parafilm nicht drängen die Einlässe und Auslass der Kammer. </li><li> Abdeckung mit einem gereinigten Objektdeckglas (62 x 56 x 0,15 mm) und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Parafilm die Kammer umgebenden. </li><li> Platzieren zwei Wärmeblöcke, die zuvor bei 120 ° C erhitzt, auf der Durchflusszelle auf einen konstanten Druck auf sie anzuwenden. Lassen Sie die Parafilm Schmelze für ca. 25 min. </li></ol></li><li> Druckspeicher und Pufferbehälter Der Druckbehälter sollte aus Plexiglas (oder ähnlich) gemacht werden und erlauben Unterbringung von sechs Pufferbehälter. Die Möglichkeit, mit wenigstens zwei zusätzlichen Pufferbehälter erhöht die Flexibilität des Instrumentes. Beachten Sie, dass transparente Behälter und Rohre im Durchflusssystem Handhabung erheblich unterstützen und Fehlerbehebung von eingeschlossenen Luftblasen. Sterile Einweg-Luer-Lock-Spitze Spritzen (2,5 ml), von dem die Kolben zuvor entfernt worden ist, sind gute Pufferbehälter und ermöglichen eine einfache Verbindung mit dem Einlassrohr. Stellen Sie sicher, dassdas Gesamtfluidvolumen klein verglichen mit dem Luftvolumen in dem Druckspeicher, eine wesentliche Voraussetzung für reibungslose und stabile Strömung zu erhalten. <ol><li> Verbinden Absperrventile am Ausgang der Pufferbehälter zum Drehen des Pufferfluss oder während der Experimente. </li><li> Montieren Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Verbinden die Absperrventile in die Strömungskammer Einlässe mit Polyetheretherketon-Schlauch (Innendurchmesser ~ 150 um) und flanschlose Armaturen. Als Verbindung zwischen dem Rohr und der NanoPort Anordnungen der Strömungszelle hinzuzufügen ~ 3 cm von fluorierten Ethylen-Propylen-Schlauch (Innendurchmesser ca. 500 um). Dieser Schritt ist wichtig, um die Pufferströmung an dem Kammereingang zu reduzieren, um ein Brechen des Strömungszelle oder NanoPort Ablösen von Glas zu vermeiden. Die Verwendung von großen Rohrdurchmesser Innen allein andererseits große Mengen von biologischen Proben erfordern. </li><li> Verbinden der Flusskammer in einen offenen Auslaß-Falcon-Röhrchen bei Atmosphärendruck. DiesRohr dient als Entsorgungs für den Puffer aus dem Flusskammer fließt. </li></ol></li><li> Druck-Kontrollsystem <ol><li> Aufbau eines Drucksteuersystems in der Lage, eine Feineinstellung des Luftdrucks in dem Druckbehälter. Dies kann durch zwei computergesteuerte Magnetventile, eine an einer +0,5 atm Druckquelle (Kompressor) und die zweite zum Atmosphärendruck durchgeführt werden. Magnetventile werden wiederholt für ungefähr 7 ms zu erhöhen oder zu verringern, den Druck in der Leitung, bis der gewünschte Wert erreicht wird geöffnet. HINWEIS: Dieser Ansatz wurde von Carlos Bustamante 20 angepasst und es ergibt sich ein glatter Durchfluss als mit einem Schrittmotor Spritzenpumpe 21. </li><li> Fügen Sie einen Druckwandler mit einem individuell geschriebenen Software gesteuert, um die wirksame Druck auf den Druckbehälter ausgeübt überwachen. Typische Arbeitsdrücke liegen im Bereich von 20 mbar für Hantelanordnung und 200 mbar zum Waschen der Strömungssystemkomponenten. </li></ol></li&gt; </ol> 4. DNA-Tailing mit biotinyliertem Desoxycytidintriphosphat (Biotin-dCTP) Das DNA-Molekül sein sollte mehr als 1 um seine Erweiterung unter Fluss und die Verankerung der eingefangenen Perlen zu erleichtern. Darüber hinaus wird eine lange DNA die IR Einfangen von Licht von den Beleuchtungs DNA-Bindungsprotein zu vermeiden. Dies ist von besonderer Relevanz, da die Absorption von IR-Licht aus einem angeregten Chromophor führt zu einer erhöhten Photobleaching. HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde die DNA-Molekül 3,7 um lang. Das Molekül enthalten drei Kopien des Primär Betreiber O1 und eine Kopie von jedem der beiden Hilfsbetreiber, O2 und O3. Diese Sequenzen sind in der Mitte des Moleküls eingeführt worden ist, wodurch ungefähr gleich weit von den Kügelchen eingefangen und IR-Laserstrahlen. <ol><li> Mix 1 pmol von linearen DNA-3&#39;-Ende mit 60 pmol Biotin-14-dCTP, 4 ul 5x Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT)-Puffer (1 M Kalium CAcodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl 2 (pH 7,2 bei 25 ° C)) und 1,5 ul TdT und ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 15 min. Dies wird in der Zugabe von bis zu 60 Nukleotiden pro DNA Extremität führen. Beachten Sie, dass DNA-3&#39;-Überhänge sind mit einem höheren Wirkungsgrad als Einbau oder stumpfen Enden tailed. </li><li> Reinigen tailed DNA mit Spin-Säulen oder Phenol / Chloroform-Extraktion und anschließender Ethanol-Fällung zu CoCl 2 von der TdT Reaktionspuffer zu entfernen. </li><li> Nach der Reinigung kann die DNA bei 4 ° C für mehrere Wochen bei -20 ° C für längere Zeiträume gelagert werden, aber vermeiden maliges Auftauen und Wiedereinfrieren. </li></ol> 5. Markierungsprotein Thiolgruppen mit Atto532 Kennzeichnung durch Modifikation von Cysteinresten darf die Proteinaktivität zu verändern. Um dieses Problem zu überwinden, verwendeten wir eine LacI Mutante LacIQ231C, which trägt nur ein Cystein pro Monomer an Position 231. Diese Mutante erhält die gleichen Eigenschaften des Wildtyp-und chemische Modifikationen an Position 231 wurde gezeigt, dass nicht mit Proteinstabilität 22 stören. HINWEIS: Wir markierten das Protein mit ATTO532 Maleimid. <ol><li> Sicherzustellen, dass das Protein in einem Puffer mit einem pH im Bereich von 7,0 bis 7,5 und mit einer Konzentration im Bereich von 2 bis 10 mg / ml gelöst. HINWEIS: Bei diesen Versuchen wurde LacI in Kaliumphosphat 0,3 M, 5% Glucose, pH 7,5 (Puffer A) gelöst. </li><li> Auflösen Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) zu einer Endkonzentration von 100 mg / ml in H 2 O. TCEP-Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden. </li><li> Mischen 100 ul des Proteins mit 3 ul TCEP und Wirbel sorgfältig. </li><li> Löse den Farbstoff in N, N-Dimethylformamid (DMF) zu einer Endkonzentration von 10 mg / ml Arbeits bei schlechten Lichtverhältnissen. Vortex, bis vollständig gelöst ist. </li><li> Reaktion mix: Fügen Sie 33 ul Farbstoff an das Protein + TCEP und Wirbel sorgfältig. Fast Spin soviel Lösung wie möglich zu sammeln. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktionsmischung für 2 Stunden in einem Shaker (8.000 rpm) bei 20 ° C (oder bei 4 ° CO / N), vor Licht geschützt. </li><li> Auflösen L-Glutathion reduziert (GSH) in einer Endkonzentration von 100 mg / ml in H 2 O. Werden 3 ul der Reaktionsmischung und Inkubieren auf dem Schüttler bei 8.000 Upm für 15 min. GSH wird die Reaktion durch die Blockierung der Reaktivität von Thiolgruppen zu stoppen. </li><li> Reinigen das markierte Protein mit Standard Gelfiltrations-, Dialyse oder Spin-Konzentratoren. HINWEIS: In diesen Versuchen wurde markiert LacI mit 10 kDa Cutoff Spin Konzentratoren gereinigt. <ol><li> Verdünne das Reaktionsgemisch mit bis zu 12 ml Puffer A, anwenden, um die Konzentrationsvorrichtung, und es Zentrifuge bei 8000 × g, 1 h, 4 ° C beträgt. Das markierte LacI wird somit auf ein Endvolumen von etwa 500 ul konzentriert und das überschüssige Farbstoff die Membran passiert im flow-durch. Entsorgen Sie die Durchfluss und wiederholen Sie Schritt 5.8.1 mindestens drei Mal. </li></ol></li><li> Teilen Sie die markierten Protein in kleine Teilmengen und bei -80 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 6. Kombinierte optische Fallen und Einzelmolekül-Fluoreszenz-Imaging Experimente <ol><li> 1 ml Puffer A zu den Pufferbehälter und 200 mbar Druck anzuwenden, um die Verbindungsrohre und die Durchflusszelle zu waschen. Diffusion des Bindungsproteins an DNA, hier und in den folgenden Schritten zu maximieren, Puffer A mit einem Puffer niedriger Ionenstärke ersetzt. HINWEIS: In diesen Experimenten verwendeten wir 0.5x TBE. </li><li> Überprüfen die Anwesenheit von Luftblasen, welche die Strömung stören könnte Glätte. Ein sanfter Film auf dem Auslaufrohr wird dazu beitragen, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen. </li><li> Verringern den Druck auf 20 mbar und sicherstellen, dass alle Kanäle und Rohre sind aus Luftblasen klar und die Puffer fließt mit ähnlichen Geschwindigkeiten in allen Kanälen. </li><li>Vorbereitung der Proben auf ein Endvolumen von 300 ul: Streptavidin-beschichtete Polystyrolkügelchen 1,87 um; 20 pM von linearen DNA an beiden Extremitäten nach § 4 biotinyliert; 300 pM LacI Tetramer mit Atto532 nach § 5 gekennzeichnet. </li><li> Fügen jeder Probe mit einem der Spritzenbehälter in der folgenden Reihenfolge: Perlen in den ersten Kanal, DNA in der zweiten, dritten Kanal mit der Bildpuffer nur (Puffer A + Sauerstoff-Scavenger-System) und des markierten Proteins in dem vierten Kanal. </li><li> Schalten Sie den Flusses auf 200 mbar für 3 Minuten, damit sich die Proben innerhalb des Strömungskanals gelangen. Dann reduzieren Sie den Druck auf 20 mbar. </li><li> Während die Abbildung des ersten Kanals unter Hellfeldbeleuchtung, wechseln auf den beiden optischen Pinzette und fangen eine Polystyrol-Kügelchen in jedem Falle. </li><li> Bewegen sich schnell auf den zweiten Kanal, um zu vermeiden, dass andere Perlen in die Fallen. Beachten Sie, dass die Ankunft der DNA Kanal wird durch das Ende des Wulstes Strömungs leicht erkennbar. </li><li> Verwendung von one AOD, verschieben Sie eine Falle (Perle) in der Nähe des anderen Wulst hin und her, um die Befestigung des Fluss verlängert DNA zwischen den beiden optischen Pinzette Perlen ermöglichen. Wenn ein DNA-Hantel ausgebildet ist, beginnt die statische Wulst gemäß der Bewegung der Raupe, die aktiv von der Falle hin und her bewegt wird. </li><li> Bewegen sich schnell auf den Puffer Kanal und schalten Sie den Pufferfluss. Führen eines Kraftdehnungskurve Analyse 4,23-25 ​​um die Anwesenheit eines einzelnen DNA-Moleküls zu überprüfen. Wenn mehr als ein Molekül vorhanden ist (dh die Enthalpie, die Erhöhung Phase des Kraft-Dehnungs-Kurve tritt bei einer Länge kürzer als die DNA-Konturlänge), entsorgen Sie die Hantel und beginnen erneut bei Schritt 6.7. </li><li> Sobald ein einzelnes DNA-Hantel erhalten wird, schalten Sie den Durchfluss wieder und bewegen Sie die Hantel auf die Protein-Kanal. Wechseln Sie zu weites Feld der Fluoreszenzmikroskopie, um die Interaktion des markierten-LacI mit DNA überwachen. Schalten Sie den Strom ein und starten Akquisition. </li></ol>

<ol>
	<li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level.">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li><li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+mechanisms,+one+molecule+at+a+time.">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes &amp; development. 25, 1205-1231 (2011).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level.">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers.">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li><li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase.">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers.">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li><li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping,+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time.">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension.">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiona+in+the+trap:+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).</li><li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy:+enhanced+photobleaching+of+fluorophores.">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li><li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle.">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li><li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping.">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor,+single-molecule+fluorescence+imaging.">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li><li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA+with+optical+tweezers.">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li><li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization.">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li><li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers.">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In den letzten zehn Jahren haben Einzelmolekülmanipulation und bildgebenden Verfahren große Fortschritte in Bezug auf die räumliche und zeitliche Auflösung zu sehen. Die Kombination der Manipulation und bildgebenden Verfahren ist an der Basis wirksame Instrumente, die nun die Steuerung der mechanischen Bedingungen einer einzelnen biologischen Polymeren wie DNA, RNA oder Zytoskelett-Filamente zu ermöglichen, und der gleichzeitigen Lokalisierung von einzelnen Proteinen in Wechselwirkung mit dem gleichen Polymer . Ste...

Einzelmolekül (SM)-Techniken haben sich in den letzten dreißig Jahren entwickelt, um auf die Notwendigkeit der Überwindung einiger der Grenzen der traditionellen, Groß Lösung Messungen 1-3 reagieren. Die Manipulation von einzelnen biologischen Molekülen hat die Möglichkeit, die mechanischen Eigenschaften von Biopolymeren 4 messen und steuern die mechanischen Parameter der Protein-Protein-und Protein-5-DNA-Wechselwirkungen 6,7 erstellt. SM Fluoreszenz-Detektion auf der anderen Seite stellt ein extrem vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung der Proteinaktivität in vitro und in vivo, was zu der Möglichkeit der Lokalisierung und Verfolgung einzelner Moleküle mit Nanometer-Präzision. Durch Einpassen des Instruments Point-Spread-Funktion auf die SM Bild in der Tat kann man die Lokalisierung mit einer Genauigkeit hauptsächlich in Abhängigkeit von Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) und dem Erreichen einer Grenze von etwa einem Nanometer 8,9 zu erreichen. Diese Methoden finden leistungsstarkenAnwendungen in der Untersuchung der Dynamik von Motorproteinen, sowie der Zielsuche in der DNA-bindenden Proteinen zugrunde liegenden Diffusionsprozesse. Die Fähigkeit zur Bestimmung Diffusionskonstanten als Funktion der DNA-Sequenz, die Verweilzeit auf dem Ziel und genauen Messen der DNA-Länge während der eindimensionalen Diffusions Ereignisse erforscht sind, ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktion Dynamik und zur Untersuchung der Mechanismen der spezifischen Zielsuche. Vor kurzem hat die Kombination dieser beiden Techniken eine neue Generation von experimentellen Aufbauten 10-14 ermöglicht die gleichzeitige Manipulation einer biologischen Substrats (zum Beispiel eine Aktin-Filament oder ein DNA-Molekül) und Detektion / Lokalisierung eines interagierenden Partner-Enzym (beispielsweise hergestellt Myosin oder ein DNA-bindendes Protein). Die Vorteile dieser Technik liegen vor allem auf die Möglichkeit der Ausübung mechanischer Kontrolle über die eingefangene Polymer, wodurch ENAbling das Studium der Wechselwirkung Dynamik gegenüber Kräfte oder Drehmomente. Auch ermöglicht die Methodologie Messen biochemischer Reaktionen weit von der Oberfläche, die Vermeidung eines der wichtigsten Einschränkungen der klassischen SM Methoden, also die Notwendigkeit einer Immobilisierung der untersuchten Moleküle auf einer Oberfläche (Glasobjektträger oder Mikrokügelchen). Die Kombination von zwei einzelnen Molekülen Techniken erfordert Überwindung mehrere technische Schwierigkeiten, vor allem die aus den Anforderungen der mechanischen Stabilität und angemessene SNR 15 (vor allem, wenn die Lokalisierung mit nm Präzision erfordern). Insbesondere dann, wenn die Kopplung SM Fluoreszenzdetektion mit optischen Pinzetten, die Reduzierung von Lärm und die Photobleichung von den Fang Infrarot-Laser 16 und der Kontrolle der biochemischen Puffer für die Montage der biologischen Komplexen und die Leistung der experimentellen Messungen 11 sind von größter Bedeutung. Hier beschreiben wir die Verfahren für erfolgreicheMessungen in einem Dual-Trapping / SM Fluoreszenz-Lokalisierung-Setup. Die Methode ist mit dem Beispiel der Lactose-Repressor-Protein (LacI) fluoreszierend (bei ​​Atto532) markiert und nachgewiesen, wie es ein DNA-Molekül (zwischen zwei optischen Pinzette bewegt) bindet LacI mit spezifischen Bindungssequenzen (dh Betreiber) dargestellt. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Detektion der Bindung an DNA und LacI Diffusion entlang ihrer Kontur in der Zielsuchvorgang. Das Verfahren ist auf jede Kombination von DNA-Sequenz und DNA-bindendes Protein als auch an andere Systeme (Mikrotubuli oder Aktinfilamente und der Motor-Proteine ​​interagieren mit ihnen).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:151px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:203px;">Web Address</td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:115px;">elastomeric isolators</td>
			<td style="width:141px;">Newport</td>
			<td style="width:167px;">Newdamp</td>
			<td style="width:151px;">Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies</td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical isolator</td>
			<td style="width:141px;">Optics for Research</td>
			<td style="width:167px;">IO-3-YAG-VHP</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ofr.com/">http://www.ofr.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength</td>
			<td style="width:141px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:167px;">Millennia IR</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acousto-optic deflectors (AODs)</td>
			<td style="width:141px;">A&#38;A optoelectronic</td>
			<td style="width:167px;">DTS-XY 250</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.aaoptoelectronic.com/">http://www.aaoptoelectronic.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct Digital Synthesizers</td>
			<td style="width:141px;">Analog Devices</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.analog.com/">http://www.analog.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quadrant detector photodiodes</td>
			<td style="width:141px;">OSI optoelectronics</td>
			<td style="width:167px;">SPOT-15-YAG</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.osioptoelectronics.com/">http://www.osioptoelectronics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">DIO and FPGA board</td>
			<td style="width:141px;">National Instruments</td>
			<td style="width:167px;">NI-PCI-7830R</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ni.com/">http://www.ni.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Halogen lamp</td>
			<td style="width:141px;">Schott</td>
			<td style="width:167px;">KL 1500 LCD</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.schott.com/">http://www.schott.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Condenser</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:167px;">U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-global.com/en/">http://www.olympus-global.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Objective</td>
			<td style="width:141px;">Nikon</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:141px;">Coherent</td>
			<td style="width:167px;">Sapphire</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.coherent.com/">http://www.coherent.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CCD 200X and 2000X</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">XC-ST70 CE</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electron-multiplied CCD</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">C9100-13</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">piezo stage with nm-accuracy</td>
			<td style="width:141px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:167px;">P-527.2CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.physikinstrumente.com/">http://www.physikinstrumente.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Emission Filter</td>
			<td style="width:141px;">Chroma Technologies</td>
			<td style="width:167px;">600/100m</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.chroma.com/">http://www.chroma.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">silica beads (1.54 mm)</td>
			<td style="width:141px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">SS04N/5303</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bangslabs.com/">http://www.bangslabs.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">B4287</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pentyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">46022</td>
			<td style="width:151px;">Flammable liquid and vapour (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">nitrocellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8267-5EA</td>
			<td style="width:151px;">Flammable solid&#160; (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">heat block</td>
			<td style="width:141px;">MPM Instruments Srl</td>
			<td style="width:167px;">M502-HBD</td>
			<td style="width:151px;">with 2 removable blocks; preheated at 120&#176; C</td>
			<td><a href="http://www.mpminstruments.com/">http://www.mpminstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoPort assemblies</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">N-333</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">polyetheretherketone tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1535</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luer lock-tip syringes 2.5 mL</td>
			<td style="width:141px;">Terumo</td>
			<td style="width:167px;">SS 02LZ1</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.terumomedical.com/">http://www.terumomedical.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">shut-off valves&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">P-732</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">flangeless fittings&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">LT-111</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">fluorinated ethylene propylene tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1549</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:203px;">two computer-controlled solenoid valves</td>
			<td style="width:141px;">Clippard, Cincinnati, USA</td>
			<td style="width:167px;">ET-2-H-M5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.clippard.com/">http://www.clippard.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pressure transducer</td>
			<td style="width:141px;">Druck LTD</td>
			<td style="width:167px;">PTX 1400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotin-14-dCTP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">19518-018</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:141px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">EP0161</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.thermoscientificbio.com/">http://www.thermoscientificbio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO532 maleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">68499</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="157">
			<td height="157" style="height:157px;width:203px;">N,N-dimethylformamide (DMF)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">227056</td>
			<td style="width:151px;">Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C4706</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G4251</td>
			<td style="width:151px;">Acute toxicity, Oral (Category 5), H303</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10&#160;kDa cutoff spin concentrators</td>
			<td style="width:141px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:167px;">UFC901024</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.it/">http://www.merckmillipore.it/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 &#181;m</td>
			<td style="width:141px;">Spherotech, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">SVP-15-5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spherotech.com/">http://www.spherotech.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-dna interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

In einem erfolgreichen Versuch, eine (oder mehrere) markierte Proteine ​​unterziehen Bindung / freibleibend und / oder eindimensionalen Diffusion entlang des DNA-Moleküls (Abbildung 3A). Lokalisierung von Proteinen entlang des DNA-Moleküls ermöglicht die Quantifizierung der kinetischen Parameter als Funktion der DNA-Sequenz. Wenn Pufferbedingungen verursacht 1D Diffusion angewendet werden, ist es möglich, Protein-Trajektorien zu folgen, und zu bestimmen, beispielsweise der Diffusionskoeffizient ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions at JoVE.com

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Aufrufe.  University of Florence.  Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert. 

Serie: Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The cellular mechano-sensation of extracellular mechanical stimuli is believed to be through the membrane receptors, the associated protein complex, and the cytoskeleton. Recent advances in mechanobiology demonstrate that the cell nucleus in cytoplasm itself can independently sense mechanical stimuli simultaneously. However, a mechanistic understanding of how the cell nucleus senses, transduces, and responds to mechanical stimuli is lacking, mainly because of the technical challenges in accessing and quantifying the nucleus mechanics by conventional tools. This paper describes the design, fabrication, and implementation of a new magnetic force actuator that applies precise and non-invasive 3D mechanical stimuli to directly deform the cell nucleus. Using CRISPR/Cas9-engineered cells, this study demonstrates that this tool, combined with high-resolution confocal fluorescent imaging, enables the revelation of the real-time dynamics of a mechano-sensitive yes-associated protein (YAP) in single cells as a function of nucleus deformation. This simple method has the potential to bridge the current technology gap in the mechanobiology community and provide answers to the knowledge gap that exists in the relation between nucleus mechanotransduction and cell function.

This study presents a new protocol to directly apply mechanical force on the cell nucleus through magnetic microbeads delivered into the cytoplasm and to conduct simultaneous live-cell fluorescent imaging.

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...