Diese Methode kann helfen, die molekularen Mechanismen aufklärt, die der Regulation von Kandidatenzielgenen durch epigenetische Modifikationen während der Pilzpathogenese in der Pflanzenpathologie zugrunde liegen. Die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungstechnologie kann DNA-Segmente, die mit Histonen und Transkriptionsfaktoren im gesamten Genom interagieren, effizient nachweisen. Im Vergleich zu anderen Methoden kann es die Effizienz und Auflösung verbessern.
Beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Mikrolitern flüssigem, vollständigem Medium zu den Haferflockentomaten-Agger-Platten mit einer 100-Mikroliter-Pipette. Kratzen Sie mit einer Impfschleife die Myzelien des Wildtyp-Stammes und des Knockout-Stammes ab. Sammeln Sie die Myzelienablagerungen und übertragen Sie sie auf 250 Milliliter flüssiges vollständiges Medium.
Waschen Sie die Pilzhyphen mit 500 Millilitern 0,7 molarer Natriumchloridlösung. Dann sammeln Sie den Pilz myceliUM und wiegen Sie ihn. Fügen Sie etwa einen Milliliter Lyseenzympermeationslösung pro Gramm des Pilzmyzels hinzu.
Legen Sie die Hyphen zum Schneiden bei 28 Grad Celsius für drei bis vier Stunden mit Schütteln bei 150 U / min. Waschen Sie die liced Hyphen mit 50 Millilitern 0,7 molarer Natriumchloridlösung. Zentrifugieren Sie die Probe und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
Suspendieren Sie den Protoplasten in 20 Millilitern 0,7 molarer Natriumchloridlösung. Fügen Sie 55 Mikroliter 37% Formaldehyd Tropfen für Tropfen zu zwei Milliliter Natriumchloridpuffer hinzu, die Protoplasten zur Vernetzung enthalten, bis die Endkonzentration 1% beträgt Um das nicht umgesetzte Formaldehyd abzuschrecken, fügen Sie 20 Mikroliter 10-faches Glycin zu jedem Röhrchen hinzu. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation vorsichtig.
Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 0,7 molarer Natriumchloridlösung. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet in 750 Mikroliter RIPA-Puffer erneut. Fügen Sie 37,5 Mikroliter 20-facher Proteaseinhibitor hinzu.
Scheren Sie das Chromatin durch Beschallung für acht Minuten mit einem Ultraschallhomogenisator. Nachdem die Probe mit Ultraschall gebrochen wurde, nehmen Sie einen Teil der Probe als Input heraus, der die gesamte DNA und das Protein enthält, die nach der Beschallung der Probe freigesetzt werden. Um die Länge der DNA-Fragmente zu analysieren, führen Sie nach der Beschallung eine 1% Agarosegel-Elektrophorese durch.
Nach der Zentrifugation den zentrifugierten Überstand in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben und bei negativen 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung lagern. Bevor Sie das IP-Experiment durchführen, verdünnen Sie jede Chromatinprobe auf ein Verhältnis von eins zu 10 mit einem einmaligen RIPA-Puffer. Pipette 50 Mikroliter superparamagnetischer Proteinperlen in ein zwei Milliliter Zentrifugenröhrchen.
Legen Sie die Röhren auf einen Magnetständer und lassen Sie die Magnetperlen ausfallen. Entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie einen Milliliter vorgekühlten einmaligen RIPA-Puffer in das Röhrchen hinzu und waschen Sie superparamagnetische Proteinperlen dreimal.
Legen Sie die Röhren auf einen Magnetständer und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 100 Mikroliter eines einmaligen RIPA-Puffers zu jedem Röhrchen hinzu. 30 Mikroliter der Chromatinprobe, 100 Mikroliter superparamagnetische Proteinperlen und vier Mikroliter H3K4me3-Antikörper werden in das Röhrchen gegeben und gut gemischt.
Legen Sie die Proben auf einen Rotationsschüttler, um sie über Nacht bei vier Grad Celsius bei 30-fachem G zu inkubieren.Waschen Sie den superparamagnetischen Proteinperlen-Antikörper und den Chromatinkomplex, indem Sie die Perlen in einem Milliliter eines ripa-Puffers wieder aufwenden. Waschen Sie die Probe mit einem Milliliter waschpuffer mit niedrigem Salzimmunkomplex, dann mit einem Milliliter Waschpuffer mit hohem Salzimmunkomplex. Spülen Sie die Perlen mit einem Milliliter Lithiumchloridpuffer ab und entfernen Sie den Überstand.
Fügen Sie dann einen Milliliter TE-Puffer in das Rohr hinzu. Legen Sie das Röhrchen erneut mit einem Milliliter TE-Puffer ein und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Fügen Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer zu jedem Zentrifugenröhrchen hinzu.
Führen Sie die Elution bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten durch. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in neuen Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie acht Mikroliter von fünf molaren Natriumchlorid zu allen Röhrchen hinzu und inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für vier bis fünf Stunden oder über Nacht, um die DNA-Protein-Querverbindungen umzukehren.
Fügen Sie einen Mikroliter Rnase A hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie vier Mikroliter Proteinase K in jede Tube und inkubieren Sie bei 45 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden. 550 Mikroliter der Fenalchloroform- und Isoamylalkoholmischung in das Zentrifugenröhrchen geben.
Zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 10.000 mal G und saugen Sie den Überstand an. Fügen Sie 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetatlösung, 2,5 Volumen absolutem Ethanol und drei Mikrolitern Glykogen in das Röhrchen hinzu. Legen Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius in einen Kühlschrank, um sie niederzufälschen.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen den Überstand. Waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter frisch zubereitetem 75% Ethanol bei 10.000 mal G.Fügen Sie 50 Mikroliter steriles entionisiertes Wasser hinzu, um den Niederschlag ausreichend aufzulösen. Reparieren Sie die DNA-Enden, um stumpfe DNA mit einem DNA-Endreparaturkit und Anweisungen im Textmanuskript zu erzeugen.
Um den drei Hauptenden Adeninbasis hinzuzufügen, fügen Sie 30 Mikroliter DNA, zwei Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter 10-fachen Taq-Puffer, 10 Mikroliter eines Millimolar-dATP und drei Mikroliter Taq-DNA-Polymerase in ein 0,2-Mikroliter-PCR-Zentrifugenröhrchen hinzu. Mischen Sie sie und reagieren Sie in einer PCR-Maschine bei 72 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie eine Linkerligatur durch, indem Sie 10 Mikroliter DNA, 9,9 Mikroliter Wasser, 2,5 Mikroliter T4-DNA-Ligasepuffer, 0,1 Mikroliter Adapter-Oligo-Mix und 2,5 Mikroliter T4-DNA-Ligase in einem 0,2-Mikroliter-PCR-Zentrifugenröhrchen mischen.
Inkubieren Sie die Tube bei 16 Grad Celsius für vier Stunden. Um die DNA mit PCR-Primern zu amplifizieren, fügen Sie 10,5 Mikroliter DNA, 12,5 Mikroliter zweifache High-Fidelity-Master-Mischung hinzu. ein Mikroliter PCR-Primer PE 1.0 und ein Mikroliter PCR-Primer PE 2.0 zu einem 0,2 Mikroliter PCR-Zentrifugenröhrchen und gut mischen.
Die H3K4me3-Signale der Deletionsmutanten mobre2, mospp1 und moswd2 waren in ihren funktionellen Zielregionen signifikant verringert. Im Vergleich zum Wildtypstamm P131 waren die Signale der angereicherten H3K4me3-Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung in den Mobre2-, mospp1- und moswd2-Deletionsmutanten weitgehend verringert. Nach diesem Verfahren können Chip-on-Chip und Chip-qPCR durchgeführt werden.
Sie werden im Allgemeinen verwendet, um das nachgeschaltete Zielgen eines Proteins zu screenen und Protein-DNA-Interaktionen an bekannten Genombindungsstellen zu untersuchen.
