Diese Methode kann in jedem Labor durchgeführt werden, das für Zellkulturexperimente ausgestattet ist. Mit dieser Methode können wir unser Verständnis der Nierenentwicklung und der Krankheitswege erweitern. Dies ist eine relativ einfache und kostengünstige Methode im Vergleich zu anderen zur Erzeugung von Nierenorganoiden.
Die größte Herausforderung dieser Technik ist die Aufrechterhaltung einer hochwertigen humanen pluripotenten Stammzellkultur. Es ist wichtig, dass die Zellen bei weniger als 80% Konfluenz gehalten und regelmäßig gespalten werden. Forscher, die neu in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind, sollten sich mit den Stammzelllinien vertraut machen, bevor sie mit der Differenzierung fortfahren.
Beginnen Sie den Nierenorganoid-Assay, indem Sie zwei Milliliter vollständiges E5-ILP-Medium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte geben. Kultivieren Sie humane pluripotente Stammzellen oder hPS-Zellen in 100-Millimeter-Gewebekultur-behandelten Platten, bis sie 60% Konfluenz erreichen. Waschen Sie die hPSCs zweimal mit etwa acht Millilitern DPBS.
Aspirieren Sie das DPBS, fügen Sie dann zwei Milliliter Dispase tropfenweise hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie sie sechs Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal mit ca. 10 Millilitern DPBS. Saugen Sie den DPBS ab, neigen Sie die Platte um 45 Grad und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellenheber nach unten.
Waschen Sie die Kolonien mit sechs Millilitern komplettem E5-ILP-Medium mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette von oben nach unten. Halten Sie dann die Pipette senkrecht und brechen Sie große Kolonien auf, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und darauf achten, die Seiten der Kulturplatte nicht zu berühren. Verteilen Sie die Koloniecluster gleichmäßig, indem Sie einen Milliliter pro Well in die Sechs-Well-Platte geben, und legen Sie die Platte dann auf einen Orbitalschüttler in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator.
Alternativ, wenn kein Orbitalshaker verfügbar ist, können die Zellen statisch kultiviert werden. Am zweiten Tag, nachdem Sie die embryoiden Körper am Boden der Platte abgesetzt haben, neigen Sie die Platte um 45 Grad und saugen Sie das Medium langsam von oben ab, so dass ein Milliliter pro Vertiefung übrig bleibt. Fügen Sie zwei Milliliter vorbereitetes komplettes Medium pro Vertiefung hinzu und bringen Sie die Platte zurück zum Shaker.
Am dritten Tag, nachdem Sie das Medium wie zuvor gezeigt absaugt haben, sammeln Sie alle embryonalen Körper sorgfältig aus jedem Brunnen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette und übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-konisches Rohr. Um alle verbleibenden embryonalen Körper zu sammeln, spülen Sie jeden gut mit einem Milliliter glukosearmem DMEM aus und fügen Sie sie demselben 50-Milliliter-konischen Röhrchen hinzu. Während Sie darauf warten, dass sich die embryonalen Körper am Boden des Röhrchens absetzen, fügen Sie zwei Milliliter Medium im Stadium II zu jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte hinzu.
Als nächstes sieben Sie große embryonale Körper aus, indem Sie ein 200-Mikrometer-Zellsieb auf ein neues 50-Milliliter-konisches Rohr legen und alle embryonalen Körper vorsichtig über das Zellsieb pipettieren. Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen fünf Millilitern DMEM ab, um alle embryonalen Körper zu sammeln, die im Sieb stecken. Verwenden Sie in späteren Stadien zunächst ein 500-Mikrometer-Sieb, um sehr große embryonale Körper auszusieben, und führen Sie dann das Filtrat durch ein 200-Mikrometer-Sieb, um sehr kleine embryonale Körper ohne Tubuli auszusieben.
Sammeln Sie die richtige Größe embryonaler Körper, zwischen 200 und 500 Mikrometern, indem Sie das 200-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr umdrehen und das Sieb mit DPBS waschen. Lassen Sie nach dem Abseihen die embryoiden Körper sich am Boden des konischen Schlauches absetzen, saugen Sie dann den Überstand ab und waschen Sie ihn mit etwa 10 Millilitern DMEM. Dann suspendieren Sie die embryonalen Körper in sechs Millilitern Stadium II-Medium.
Übertragen Sie die embryonalen Körper zurück in die ultraniedrige Befestigungsplatte mit sechs Bohrlöchern und verteilen Sie sie gleichmäßig auf die Vertiefungen. Da sich die meisten Organoide an der Oberseite der Pipette sammeln, lassen Sie am Ende etwa einen halben Milliliter stehen und berühren Sie dann vorsichtig die Spitze zu den Medien in jedem Brunnen, so dass Organoide in den Brunnen fließen können. Übertragen Sie die embryonalen Körper in einen 125-Milliliter-Spinnerkolben mit 45 Millilitern Stadium II-Medium.
Stellen Sie die magnetische Rührgeschwindigkeit auf 120 U / min ein und legen Sie den Kolben in den Inkubator. Um die embryonalen Körper oder Nierenorganoide zu füttern, lassen Sie sie sich kurz auf dem Boden des Spinnerkolbens absetzen, heben Sie dann den Deckel von einem Seitenarm des Kolbens an und legen Sie die Ansaugpipette hinein, wobei die Spitze die gegenüberliegende Innenwand berührt. Winkeln Sie die Pipette langsam nach unten und aspirieren Sie etwa die Hälfte des Mediums.
Mit 20 Millilitern frischem Stage II-Medium auffüllen, indem Sie es durch die gleiche Öffnung pipettieren. Verwenden Sie lange sterile Pinzetten, um vorsichtig einen magnetischen Rührstab in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen mit embryoiden Körpern oder Nierenorganoiden zu legen. Legen Sie die Platte auf die sechsrädrige Magnetrührplatte und stellen Sie die Drehzahl auf 120 U / min ein.
Damit die magnetischen Rührstäbe in Position rasten und sich zu drehen beginnen, stellen Sie zuerst die Leistungsstufe auf 100 ein. Sobald sich alle Balken zu drehen beginnen, senken Sie die Leistungsstufe auf 25. Halten Sie die Nierenorganoide aufrecht, indem Sie die Hälfte des Mediums wechseln, wie zuvor gezeigt.
Die Immunfluoreszenz von Paraffinabschnitten von Tag 14 Nierenorganoiden zeigt das Vorhandensein von Nephronsegmenten wie Nierentubuli, die Hepatozyten-Kernfaktor-1-beta und Lotus tetragonolobus-Lektin exprimieren, sowie Podozytencluster, die V-maf muskuloaponeurotisches Fibrosarkom Onkogenhomolog B und Nephrin exprimieren. Die Modifikationen in diesem Protokoll können die Expansion von Endothelzellen unterstützen, wie durch Färbung mit Thrombozyten- und Endothelzelladhäsionsmolekül-1 am Tag 26 der Kultur bestätigt wird. Menschliche pluripotente Stammzellen müssen für die entsprechende Zeit mit Dispase behandelt und dann gründlich gewaschen werden, um alle Spuren zu entfernen.
Wenn Dispase nicht vollständig entfernt wird, kann dies zum Zelltod und zur Clusterbildung embryonaler Körper führen. Diese Methode hat uns geholfen, die Entwicklung von angeborenen Nierenerkrankungen sowie verschiedene Nierenverletzungswege und das Potenzial für therapeutische Interventionen in vitro zu untersuchen.
