Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine komplexe 3D-Struktur zu erstellen, die dem sich entwickelnden menschlichen Herzen auf einfache, kostengünstige Weise sehr ähnlich ist und über Zelllinien hinweg reproduzierbar ist. Es besteht aus einem einzigen Protokoll mit drei Differenzierungsschritten, aus dem alle Zelltypen des Herzens hervorgehen, einschließlich Kammern und eines vaskulären Netzwerks. Diese Technik ermöglicht es uns, eine breite Palette von menschlichen Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu modellieren und wirksame pharmakologische Behandlungen zu screenen.
Dank des hohen Durchsatzes seines Designs. Diese Methode ist nützlich, um das sich entwickelnde menschliche Herz sowie Krankheiten, die üblicherweise damit verbunden sind, zu untersuchen. Einer von ihnen sind angeborene Herzfehler.
Dieses Protokoll erfordert grundlegende Zellkulturkenntnisse. Wir empfehlen ein aufmerksames und zartes Pipettieren sowie einen schonenden Umgang mit den Organoiden. Beginnen Sie mit der Schaffung von embryoiden Körpern oder EBs zwei Tage vor der Differenzierung.
Waschen Sie subkonfluente HPSCs mit DBPS für mindestens 10 Sekunden. Dann aspirieren Sie den DPBS. Fügen Sie einen Milliliter ACUTA bei Raumtemperatur hinzu und klopfen Sie drei bis fünf Minuten lang etwa fünfmal pro Minute vorsichtig auf die Platte, um eine Ablösung zu induzieren, während Sie unter dem Mikroskop nachsehen.
Dann fügen Sie einen Milliliter PSC-Medium und Thias Avin oder Thias hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Pipettieren Sie das Medium zwei- bis dreimal im Bohrloch auf und ab, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen und die Zellen zu sammeln. Dann die Einzelzellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen übertragen und fünf Minuten lang bei 300 mal G.Aspiratieren Sie den Überstand und geben Sie die Zellen in einem Milliliter PSC-Medium und Thias erneut aus.
Verdünnen Sie die Zellen in DPBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler oder Hämozystometer und verdünnen Sie die Zellen in PSC-Medium mit Thias auf eine Konzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter. Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnte Zellsuspension zu jeder Vertiefung einer runden Bodenplatte mit extrem niedriger Befestigung 96 Vertiefung hinzu.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 mal G für drei Minuten und inkubieren Sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden vorsichtig 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung entfernen und 200 Kernstreu frisches PSC-Medium hinzufügen, warm auf 37 Grad Celsius für ein Volumen von 250 Mikrolitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Entfernen Sie 166 Mikroliter oder zwei Drittel des Mediums von einer Seite jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter RPMI 1640 hinzu, die insulinfreies B27-Präparat enthalten, sechs mikromolare Cheer-990211, 0,875 Nanogramm pro Milliliter knochenmorphogenetisches Protein vier und 1,5 Nanogramm pro Milliliter Activin A.Incubate für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden werden 166 Mikroliter Medium von einer Seite jeder Vertiefung entfernt und 166 Mikroliter frischer RPMI 1640 mit insulinfreiem B27-Präparat hinzugefügt. 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.
Um die Kardiodermspezifikation am zweiten Tag zu induzieren, entfernen Sie 166 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter RPMI 1640 hinzu, die insulinfreies B27-Präparat und drei mikromolaren Wnt-C59 enthalten, und setzen Sie die Inkubation für 48 Stunden fort. Am vierten Tag entfernen Sie 166 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter frisches RPMI 1640 mit insulinfreiem B27-Präparat hinzu und inkubieren Sie dann weitere 48 Stunden. Entfernen Sie am sechsten Tag 166 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter RPMI 1640 mit B27-Ergänzung hinzu.
Für diese und alle nachfolgenden Medienwechsel verwenden Sie B27 Ergänzung mit Insulin, inkubieren Sie für weitere 24 Stunden. Am siebten Tag ist die Zellkultur bereit für die pro-epikardiale Differenzierung. Entfernen Sie 166 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter frische RPMI 1640 hinzu, die B27-Ergänzung und drei Mikromolar cheer 99021 enthalten.
Dann in Inkubation für eine Stunde, nach einer Stunde entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie 166 Mikroliter Medium von einer Seite jeder Vertiefung und fügen Sie 166 Mikroliter frische RPMI 1640 mit B27 Ergänzung fügen Sie die Inkubation für weitere 48 Stunden fort. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 48 Stunden bis zur Abholung. Organoide sind am Tag 15 bereit für Analysen und Experimente Um die gesamten Organoide zu übertragen, schneiden Sie die Spitze einer P200-Pipette fünf bis 10 Millimeter von der Öffnung mit einem Durchmesser von etwa zwei bis drei Millimetern ab.
Drücken Sie den Pipettenkolben und führen Sie die Spitze mit dem Organoid senkrecht in die runde Bodenmulde ein. Nehmen Sie etwa 100 bis 200 Mikroliter Medium auf, um die Organoide zu sammeln und zum Zielort zu transportieren. Bevor differenzierungs-EBS als schwarze sphärische Massen erscheinen, beginnt der Differenzierungsprozess am Tag Null mit einer Wnt-Signalwegaktivierung und Wachstumsfaktorzugabe für genau 24 Stunden.
Darüber hinaus führt die Bearbeitung von Wnt C59 am zweiten Tag zu einer Vergrößerung des Organoids von etwa 200 Mikrometern auf maximal einen Millimeter. Die menschlichen Herzorganoide begannen bereits am sechsten Tag zu schlagen und 100% der Organoide zeigten am Tag 10 einen sichtbaren Schlag. Hochvergrößerungsbilder des Organoids des siebten Tages zeigten, dass die meisten Hand-eins-exprimierenden Zellen Kardiomyozyten im Ursprung waren und Hand zwei nicht-myosite Zellen aus dem zweiten Heartfield, Vorläuferzellen.
RNA-Transkripte für Hand eins und Hand zwei wurden ab dem dritten Tag in RNA-Sequenzierungsdaten exprimiert. Die FHF-Marker waren an den Tagen drei und 11 stark exprimiert, während der SF-Marker nach Tag 13 stärker exprimiert wurde. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte das Vorhandensein verschiedener menschlicher Herzzelllinien, aus denen das menschliche Herz besteht.
Wie Myokard- und Epikardgewebe, Endokardzellen, Endothelzellen und kardiale Fibroblasten. Die Marker, die die oben genannten Zelllinien exprimieren, wurden auch in den RNA SAC-Genexpressionsprofilen beobachtet. Die Live-Calcium-Bildgebung einzelner Zellen in ganzen Organoiden wurde verwendet, um die elektrophysiologische Funktion der Organoide zu messen.
Die Fluo-4-Fluoreszenzintensität variierte im Laufe der Zeit aufgrund des Kalziumeintritts aus der Zelle, der regelmäßige Aktionspotentiale aufdeckte. Wärmekarten, die Kalziumintensitäten über einen Bereich mit hoher Vergrößerung des Organoids zeigen, zeigen eine erhöhte Intensität aufgrund von Kalziumtransienten und einzelnen Zellen. Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, denken Sie daran, dass die EBs und nachfolgende Organoide nicht an der Unterseite der Platte befestigt sind, und wir werden mit der Entfernung zusätzlich von Medien fortfahren, die aufmerksame Medienwechsel erfordern.
Organoide können für längere Zeiträume kultiviert werden, die in Reifungstechniken eingeführt werden, oder sogar externen Reizen wie mechanischer oder elektrischer Konditionierung und sogar Stressoren wie Toxinen ausgesetzt sein. Diese Technik ermöglicht den Zugang zu Stadien der menschlichen fetalen Herzentwicklung, die in der Forschung sonst unzugänglich sind, und ebnet den Weg für neue Einblicke in die Herzentwicklung und krankheitsbedingte Ätiologie.
