Eine verallgemeinerte Methode zur Bestimmung der frei löslichen Phenolsäurezusammensetzung und der antioxidativen Kapazität von Getreide und Hülsenfrüchten. Vollkornprodukte, einschließlich Getreide und Hülsenfrüchte, bilden einen wesentlichen Teil der menschlichen Ernährung. Ihre ernährungsphysiologische Relevanz für den Menschen ist seit langem anerkannt.
In jüngster Zeit wurden jedoch ihre antioxidativen schützenden gesundheitlichen Vorteile berichtet. Phenolsäuren, die in den äußeren Getreideschichten von Getreide und der Samenschale von Hülsenfrüchten vorkommen, tragen zu den antioxidativen Eigenschaften von Vollkornprodukten bei. Sie fangen freie Radikale ab, die oxidative Schäden an Biomolekülen verursachen.
Die beiden Klassen von Phenolsäuren, die in Vollkornprodukten vorkommen, sind Hydroxybenzoesäuren und Hydroxyzimtsäuren. Diese Studie bietet eine einfache Methode zur Extraktion von Vollkornphenolsäuren und zur Bestimmung ihrer antioxidativen In-vitro-Kapazität. Verwenden Sie fünf Vollkornproben für diese Studie, Hartweizen, gelben Mais, schwarzäugige Kuhbohnen, Sojabohnen und rote Kidneybohnen.
Wiegen Sie 100 Milligramm der Vollkornmehlprobe direkt in ein bernsteinfarbenes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von zwei Millilitern. Die dunkle Farbe der Tube hilft, die Lichteinwirkung der Mischung zu verhindern. Fügen Sie einen Milliliter 80% wässriges Methanol zu jedem der Röhrchen hinzu, die Beispiele enthalten.
Kurz vorwirbeln, um die Methanollösung zu mischen und zu probe. Beschallen Sie die Proben für 60 Minuten, um die frei löslichen phenolischen Verbindungen zu extrahieren. Legen Sie eine Abdeckung über die Proben für die Dauer der Beschallung, um zusätzlichen Schutz vor Licht zu erhalten.
Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Mischungen bei 20.000 mal G für fünf Minuten, um die festen Rückstände zu sedimentieren und den Überstand oben zu lassen. Freie phenolische Verbindungen werden nach der Zentrifugation im Überstand vorhanden sein. Der Überstand muss vor der Injektion in das HPLC-Instrument gefiltert werden.
Um den Überstand zu filtern, entfernen Sie den Kolben einer 3-ml-Spritze und befestigen Sie einen Spritzenfilter. Der Filter sollte eine Porengröße von nicht mehr als 0,22 Mikrometern haben. Pipette etwa 0,4 Milliliter des Überstands in die Oberseite der Spritze.
Setzen Sie den Kolben wieder ein und drücken Sie die Flüssigkeit durch den Filter in eine HPLC-Durchstechflasche, die einen Durchstechflascheneinsatz enthält. Sobald das Gerät so eingerichtet wurde, dass es die im Manuskript beschriebene Methode für die HPLC-Analyse ausführt, laden Sie die Fläschchen in das Karussell, um der Probenliste zu entsprechen. Erhalten Sie HPLC-Chromatogramme bei 320 Nanometern und 280 Nanometern, die deutliche Spitzen zeigen, die verschiedene phenolische Verbindungen darstellen.
Mit geeigneten Standardkurven quantifizieren Sie Hydroxyzimtsäuren bei 320 Nanometern, da sie bei dieser Wellenlänge eine maximale Absorption aufweisen. Nach dem gleichen Prinzip quantifizieren Sie Hydroxybenzoesäuren bei 280 Nanometern. Verwenden Sie Trolox, ein wasserlösliches Analogon von Vitamin E, als Standard, um die in-vitro-antioxidative Kapazität der Vollkornextrakte abzuschätzen.
Wägen Sie ein Milligramm Trolox genau in eine Falcon-Röhre. Mit vier Millilitern 50% wässrigem Methanol auflösen, um eine Stammlösung von einem Millimol pro Liter herzustellen, was 1000 Mikromol pro Liter entspricht. Bereiten Sie sechs Konzentrationen von Trolox vor, die 50, 100, 200, 400, 600 und 800 Mikromol pro Liter betragen, um Standardkurven für die Schätzung der DPPH-Radikalfängerkapazität und der äquivalenten antioxidativen Kapazität von Trolox, TEAC, aufzuzeichnen.
In ähnlicher Weise werden 6,25, 12,5, 25 und 50 Mikromol pro Liter Trolox-Konzentrationen zur Schätzung der Sauerstoffradikalabsorptionskapazität, ORAC, hergestellt. Machen Sie das Gesamtvolumen jeder Konzentration auf 500 Mikroliter aus, wie in der ersten Tabelle dargestellt. Verdünnen Sie die Probenextrakte vor der Analyse mit Methanol.
Hier wurden gelbe Mais- und Kuhbohnenextrakte zweimal verdünnt. Die Weizen- und Kidneybohnenextrakte wurden fünfmal verdünnt, während der Sojabohnenextrakt 10-mal mit Methanol verdünnt wurde. Wiegen Sie 8,23 Milligramm ABTS in ein sauberes, bernsteinfarbenes Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von zwei Millilitern.
Als nächstes wiegen Sie 1,62 Milligramm Kaliumpersulfat in ein sauberes, bernsteinfarbenes Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von zwei Millilitern. Lösen Sie jede der gewogenen Chemikalien in einem Milliliter destilliertem Wasser durch Vortexing auf. Daraus ergibt sich eine 16-millimolare ABTS-Lösung und eine sechs-millimolare Kaliumpersulfatlösung.
Bereiten Sie die ABTS-Stammlösung vor, indem Sie die ABTS- und Kaliumpersulfatlösungen in gleichen Mengen mischen. Die Lösung ändert sich sofort in eine dunkle Farbe. Lassen Sie diese Mischung 12 bis 16 Stunden in der Dunkelheit inkubieren.
Verdünnen Sie die ABTS-Stammlösung 30 Mal mit 200 millimolar phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die ABTS-Arbeitslösung zu bilden. Fügen Sie dazu 58 Milliliter 200 Millimolar PBS zu zwei Millilitern der ABTS-Arbeitslösung hinzu. Die Arbeitslösung enthält 0,27 millimolare ABTS und 0,1 millimolar Kaliumpersulfat.
Für die Analyse geben Sie 10 Mikroliter jedes verdünnten Extrakts in eine 96-Well-Mikrotiterplatte. Fügen Sie 190 Mikroliter ABTS-Arbeitslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie für 60 Minuten. Messen Sie die Absorption der Reaktionsgemische bei 750 Nanometern in einem Mikroplattenleser.
Verwenden Sie die Trolox-Standards in Konzentrationen von 100 bis 800 Mikromol pro Liter, um eine Kalibrierkurve zu zeichnen. Der DPPH-Antioxidans-Assay erfordert eine radikal erzeugende Verbindung, DPPH. Wiegen Sie 1,2 Milligramm DPPH in ein leeres Zentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 15 Millilitern.
Lösen Sie den DPPH in Methanol auf, um eine 60-Mikromol-Lösung herzustellen. Der DPPH-Assay testet die Fähigkeit der Probenextrakte, von DPPH produzierte freie Radikale abzufangen. Fügen Sie fünf Mikroliter Probenextrakt in die Mikrotiterplattenvertiefungen hinzu.
Als nächstes fügen Sie 195 Mikroliter 60 mikromolare DPPH-Methanollösung hinzu und inkubieren Sie für 60 Minuten. Messen Sie die Absorption bei 515 Nanometern. Verwenden Sie die Trolox-Standards, um eine Kalibrierkurve zu zeichnen.
Abbildung eins zeigt die Struktur der Hydroxybenzoesäuren, die in den Vollkornprodukten vorkommen. In dieser aktuellen Studie war Vanillsäure die einzige identifizierte Hydroxybenzoesäure. Abbildung zwei zeigt die Struktur von Hydroxyzimtsäuren, die in Vollkornprodukten vorkommen.
In der aktuellen Studie wurden p-Cumarin-, Kaffee- und Ferulasäuren in den Proben identifiziert. Tabelle zwei zeigt die in den Proben identifizierten Phenolsäuren. Wie bereits erwähnt, war Vanillsäure die einzige Hydroxybenzoesäure, die in den Proben identifiziert wurde.
Es wurde nur im Kuhbohnenextrakt identifiziert. Die Hydroxyzimtsäure-Kaffeesäure wurde nur in Kidneybohnen identifiziert, während p-Cunersäure in gelbem Mais, Kuhbohnen und Sojabohnen identifiziert wurde. Ferulasäure wurde in allen Proben identifiziert und war die vorherrschende Phenolsäure in den Proben.
Die Gesamtkonzentration der Phenolsäuren in der Reihenfolge vom größten zum niedrigsten war in der Reihenfolge Sojabohnen, Kuhbohnen, gelber Mais und Kidneybohnen oder gleichwertig, gefolgt von Weizen. Tabelle drei zeigte den Gesamtphenolgehalt und die antioxidative Kapazität der Proben. Die antioxidative Kapazität umfasste die DPPH-Radikalfängerkapazität, TEAC, ORAC und die gesamte antioxidative Kapazität der Proben.
Die gesamte antioxidative Kapazität ist die Summe der DPPH-, TEAC- und ORAC-Werte. Ähnlich wie Tabelle zwei hatte Sojabohnen die höchste antioxidative Gesamtkapazität. Anstelle von Kuhbohnen war es jedoch eher eine Kidneybohne, die die zweithöchste antioxidative Gesamtkapazität aufwies, obwohl Kuhbohnen den zweithöchsten Gesamtphenolsäuregehalt aufwiesen.
Diese Anomalie hängt mit den Strukturen der einzelnen Phenolsäuren und der möglichen antagonistischen Wirkung der Hydroxybenzoesäurevanillsäure auf die antioxidative Wirkung der Hydroxyzimtsäuren in Kuhbohnen zusammen. Diese Studie kam zu dem Schluss, dass sich Vollkornprodukte in ihrer Phenolsäurezusammensetzung unterscheiden. Unter den untersuchten Vollkornprodukten hat Sojabohnen die höchste Gesamtmenge an Phenolsäuren und dementsprechend die höchste antioxidative Kapazität.
