Finanzielle Unterstützung aus dem Ministero dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) und Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555) sowie das Sponsoring von COST Action CM0603 auf &quot;Free Radicals in Chemical Biology and COST Action CM1201 on &quot;Biomimetic Radical Chemistry&quot; werden dankbar anerkannt.

Ein. Synthese von Mono-trans-Isomere von Cholesterylestern <ol><li> Aufzulösen Cholesterylestern (Linoleat oder Arachidonat Cholesterylester) in 2-Propanol (15 mM). Zum besseren Solubilisierung wurden die Proben für 15 Minuten unter Argon mit Ultraschall behandelt. </li><li> Die Lösung wird in einem Quarz-photochemischen Reaktor, add 2-Mercaptoethanol in 2-Propanol (bis 7 mM Konzentration zu erreichen, von einer 2 M Stammlösung des Thiol). Spülen der Reaktionsmischung mit Argon für 20 min, um die Anwesenheit von Sauerstoff in der Lösung zu beseitigen. </li><li> Bestrahlen der Reaktionsmischung mit UV-Licht unter Verwendung einer niedrigen 5.5W Quecksilberhochdrucklampe bei 22 ± 2 ° C für 4 min. Monitor durch analytische Ag-TLC (Silber-Dünnschichtchromatographie) zum Nachweis der Bildung der mono-trans Cholesterylestern (siehe Abbildung 1 für die chemische Formeln). Die TLC-Färbung erfolgt durch Gießen der Platte in der Cer-Ammonium molibdate (CAM)-Lösung durchgeführt, und die Flecken beim Erhitzendie Platte. Die Reaktion wird in einem frühen Stadium, um das Ausgangsmaterial, das wiederverwendet zu anderen Runden der Isomerisierung, Erhalten einer Erhöhung der Gesamtausbeute durchführen kann erholen. </li><li> Sammeln das Reaktionsgemisch in einem Rundkolben, Waschen der Apparatur mit einigen ml 2-Propanol. Entfernen des Lösungsmittels und Reinigung der Mono-trans Isomeren von Cholesterylestern durch Ag-TLC wie in der Literatur beschrieben. 5 Verwendung Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens für Mono-trans Isomeren Cholesteryl-Linoleat, wohingegen die Verwendung Hexan -Diethylether-essigsäure (9:1:0,1 v / v) für Mono-trans Cholesteryl Arachidonat Isomere. </li></ol> 2. Isolation von Cholesterylestern Fraktion aus menschlichem Serum <ol><li> Verdünnte 1 ml Humanserum (erhalten durch Zentrifugation des Blutes) mit 1 ml Kochsalzlösung und die Lösung in einem Scheidetrichter unter einem Argonstrom um Artefakte (zB Oxidation Addukte) zu vermeiden. 10 ml Chloroform-Methanol (2: 1 v / v) dreimal. Schütteln den Scheidetrichter nur langsam um die Bildung der Emulsion durch die Gegenwart von Albumin zu begrenzen. </li><li> Wäscht die organischen Schichten einmal mit Kochsalzlösung (10 ml), dann in einem Erlenmeyerkolben sammeln unter einem Argonstrom, über wasserfreiem Natriumsulfat. Entfernen von flüchtigen Rotationsverdampfer zu einem gelben Öl (gesamten Plasma Lipidfraktion) zu ergeben. </li><li> Aufnahme der rohen mit 1 ml Chloroform-Methanol (2:1 v / v), Last auf eine präparative TLC unter einem Strom von Argon und eine Mischung aus Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens . Abkratzen Kieselsäure enthaltenden Abschnitt der Cholesterylester Fraktion und gießen Sie in einem Fläschchen. Dann extrahiert Siliciumdioxid (3 × 5 ml) mit Chloroform-Methanol (2:1 v / v), sammeln die organischen Schichten und Entfernen des Lösungsmittels nach dem Eindampfen das reine Fraktion von Cholesterylestern (normalerweise ~ 1,5 mg) zu ergeben. </li><li> Halten Cholesterylestern in einer dunklen Glasflasche mit Aluminiumfolie unter Argon und speichern abgedeckt bei -20 ° C. Cholesteryl esters sind empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff. </li></ol> 3. Charakterisierung von Mono-trans Cholesterylestern durch Raman-Spektroskopie <ol><li> Auszug Cholesterylestern aus menschlichem Serum (≥ 0,7 mg), wie in Abschnitt 2 beschrieben, in einer kleinen Menge von Tetrachlorkohlenstoff (≤ 10 ul) und in einem Fläschchen aufzulösen. CCl 4 als Lösungsmittel gewählt, weil seine Raman-Signal nicht mit dem Bereich von Interesse von Cholesterylester Analyse überlappen. </li><li> Die Lösung wird in den Probenhalter durch einen Einweg Glaspipette, dann vorsichtig das Lösemittel durch einen langsamen Strom von Argon. Sobald eine gleichmäßige öligen Film auf der Innenwand des Probenhalters ausgebildet ist, versetzen die letztere in das Instrument für die Messung. </li><li> Fouriertransformiert Ramanspektrum von Cholesterylestern direkt auf der Lipidextrakte ohne Derivatisierungsreaktion erzielt. Die Laserleistung auf der Probe &lt;100 mW zu Probe zu vermeiden. Die Gesamtzahl von Abtastungenfür jedes Spektrum ist ≥ 800 um das Hintergrundrauschen zu minimieren. </li><li> Die 1,700-1,630 cm -1 des Raman-Spektrums analysiert wird, da sie die Abgabe auf die C = C-Doppelbindungen im Molekül (C = C-Streckschwingung) spiegelt. Eine Kurvenanpassung Analyse basiert auf diesem Gebiet durchgeführt, wodurch die Unterscheidung der überlagerten Beiträge von cis-und trans-Doppelbindungen in der Fettalkylkette und Doppelbindung im Ring B von Cholesterin (siehe Abbildung 2). </li><li> Um richtig die Banden passen, sollten einige Parameter fest oder eingeschränkt in vernünftigen Grenzen. Die Komponente Peakprofile werden als eine lineare Kombination von Lorentz-und Gauß-Funktionen beschrieben, während die halbe Höhe Bandbreiten besten durch den Computer Optimierungsroutine ermittelt werden. Die Anzahl und die Position der Komponente Peaks werden durch Verwendung des vierten Ableitungsspektren, die auch erkennen einige schwache Komponente Bands erlauben erhalten. Da das SignalRausch-Verhältnis das auf Differenzierung des Signals verschlechtert können die Verwendung des vierten Derivat auszuschließen, geglättet vierte Derivate mit einer Dreizehn-Punkt Savitsky-Golay-Funktion, von Vorteil; somit ein Kompromiss zwischen der rechten Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird . Beste Kurvenanpassung auf der niedrigsten möglichen c 2 erhaltenen Werte. </li><li> Die Anwesenheit von trans-Isomere wird durch die Komponente bei 1671 ± 1 cm -1 zusätzlich zu zumindest die beiden Komponenten, leicht zu niedrigeren Frequenzen hin verschoben wird, aufgrund der Fettsäurekette und Cholesterin C = C-Doppelbindungen offenbart. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester ist in 9 gezeigt. Im Einschub der Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Mono-trans Cholesteryl Linolsäureisomeren gezeigt. </li></ol> 4. Derivatisierung zu Fatty Acid Methylester (FAME) und Analyse mittels Gaschromatographie <ol><li> AuflösenCholesterylestern (~ 1,5 mg) mit 0,5 ml einer 1 M Lösung von Natriumhydroxid in Methanol-Benzol (2:3 v / v) und in einen dunklen Fläschchen durch Aluminiumfolie unter Argon abgedeckt. </li><li> Lassen Sie die Mischung unter Rühren bei Raumtemperatur und Monitor durch DC unter Verwendung einer Mischung von Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens. Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 30 Minuten Reaktion aber eine sorgfältige Überwachung erforderlich. In der Tat, wenn die entsprechenden Methylester gebildet werden, muß die Reaktion abgeschreckt, um die Bildung von Abbau-und Nebenprodukten zu vermeiden. TLC zeigten die quantitative Bildung von Methylestern. </li><li> Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung und extrahiert Methylester mit n-Hexan (3 × 2 ml). Sammeln der organischen Schichten in eine Phiole und Entfernen des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um den Methylester Fraktion, die dann für die GC-Analyse wird ohne weitere Reinigung verwendet leisten. </li><li> Man löst die Methylester in der Mindestmenge n-Hexan (üblicherweise 1 mg in 50 ul) und injizieren im GC mit einer 60 m × 0,25 mm × 0,25 um (50%-Cyanopropyl)-Methylpolysiloxan Kolonnenkopf ausgestattet. Verwenden einen Flammenionisationsdetektor (FID) mit folgendem Programm Ofen: Temperatur Beginn bei 165 ° C für 3 min, durch Erhöhung von 1 gefolgt halten ° C / min bis zu 195 ° C, für 40 min, gefolgt von einer zweiten halten Erhöhung von 10 ° C / min bis zu 240 ° C und für 10 min halten. Ein konstanter Druck-Modus (29 psi) ausgewählt wird. Helium oder Wasserstoff als Trägergas verwendet werden. Methylester werden durch Vergleich mit den Retentionszeiten von authentischen Proben identifiziert. Abbildung 10 zeigt eine repräsentative GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten. </li></ol> 5. Synthese von (5&#39;R) - und (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin <ol><li> Man löst 33 mg 8-Brom-2&#39;-desoxyadenosin (8-Br-DADO) in Acetonitril (100 ml), um 1 mM Konzentration erreichen. Regeln Gasstrom (Ar oder N2) im Photoreaktor und füllen den apparatus mit der Lösung von 8-Br-DADO. </li><li> Vorbereiten eines Septums mit der entsprechenden Größe für die Eingangs-und Photoreaktor passieren eine Nadel, die mit dem Inertgas Linie durch die Mitte davon. Schließen Sie das System mit dem Septum. Spülen des Inertgases für 30 min. </li><li> Strahlen durch UV-Licht mit einer 125W Quecksilber-Mitteldruck-Lampen bei 22 ± 2 ° C für 15 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml-Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Acetonitril und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. </li><li> Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) unter bekannten Bedingungen und vergleichen das Profil mit Referenz-Verbindungen. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit einer analytischen Säule (siehe Instrumentierung Abschnitt) mithilfe der folgenden solLüftungsschlitze und Steigungen: 2 mM Ammoniumformiat als Lösungsmittel A und Acetonitril als Lösungsmittel B. Setzen Sie die Flussrate auf 1 ml / min und der Gradient von 0% Lösungsmittel B bis 0,3% Lösungsmittel B in 2,2 min erreicht werden. Dann wurden 0,8% Lösungsmittel B in in 4,0 min, dann 1% Lösungsmittel B in 4,8 min. Unverändert auf 1% Lösungsmittel B für 9 min und dann bis 8% Lösungsmittel B in 6 min. Nach gehe zu 10% Lösungsmittel B in 4 min und 30% Lösungsmittel B in 5 min und bleiben bei 30% Lösungsmittel b für andere 5 min. Sammeln der chromatographischen Peaks, die den beiden diastereomeren Produkte in zwei verschiedene Ampullen. </li><li> Die Extinktion der beiden gesammelten Fraktionen im UV-Spektrophotometer und berechnen die exakte Konzentration auf der Lamber-Beer-Gesetz (A = εlC, wobei A die Extinktion der Extinktionskoeffizient ε und l die Länge der Zelle) basiert. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2&#39;-Desoxyadenosin (Dado) (15.400 M -1 cm -1 bei 260 nm). </li></ol> 6. Synthese von (5&#39;R) - eind (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyguanosin <ol><li> Man löst 35 mg 8-Brom-2&#39;-desoxyguanosin (8-Br-dGuo) und 30 mg Natriumiodid (NaI) in destilliertem Wasser (100 ml) um 1mm und 2mm Konzentration zu erreichen sind. Regulate Inertgas (Ar oder N 2) fließen mit dem Photoreaktor und füllen Sie den Photoreaktor mit der Reaktionslösung. </li><li> Entgasen das Reaktionsgemisch wie in Verfahren 5 beschrieben (Schritt b). </li><li> Durch UV-Licht bestrahlt Verwendung einer 125W-Mitteldruck-Quecksilberlampe bei 22 ± 2 ° C für 30 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Wasser und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. </li><li> Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Vakuum. </li><li> Führen Analyse wie in Prozedur 5 beschrieben (Schritte e bis g). Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2&#39;-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 bei 260 nm). </li></ol> 7. Synthese von Isotopen markiertes Purine (5&#39;R) - und (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclonucleosides <ol><li> Planen 2 ml 1 mM wässrige Lösung (destilliertes Wasser) von den 15 N Isotopen markierten Purinnukleoside ([15N 5] DADO oder [15N 5] dGuo) in einem Glasfläschchen (4 ml) mit einem Septumverschluss. </li><li> Schließen Sie das Fläschchen mit dem Septum und an der Gasleitung (N 2 O für die Sättigung der Lösung) durch eine Nadel in der Scheidewand, die den Boden des Fläschchens erreicht. Eine weitere kurze Nadel im Septum arbeitet als Gasaustritt. </li><li> Spülen Sie die Lösung mit N 2 O für 30 min. Der Gasstrom wird so reguliert, sehr gering sein. </li><li> Die Ausfahrt Nadel ersten herausgenommen und nach 1 &#39;der Lange folgt, um einen kleinen Druck im Inneren des Fläschchens haben. </li><li> Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse für 8 h (Berechnung auf der Grundlage einer Dosisrate ca. 4,5 Gy / min). </li><li> Nach der Reaktion zu stillen das Rohprodukt mit 1 M NH 4 </sub&gt; OH Lösung. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) unter bekannten Bedingungen, 6 und vergleichen Sie das Chromatogramm mit den Standard-Referenzen. </li></ol> 8. Gamma Radiolyse von DNA wässrigen Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml von 0,5 mg / ml Lösung (destilliertes Wasser) von Kalbsthymus-DNA und in einem Glasfläschchen (2 ml) mit einem Septum. </li><li> Entgasen die Reaktion nach Verfahren 7 beschrieben (Schritte bd). </li><li> Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse und 30 min (Berechnung auf der Basis der Dosis / Rate ca.. 4,5 Gy / min). </li></ol> 9. Enzymatische Verdauung von DNA <ol><li> In ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 80 ug DNA, fügen 8 U von Nuklease P1, 0,01 U von Phosphodiesterase II, 20 nmol EHNA in 20 ul 300 mM Natriumacetat (pH 5,6) und 10 mM Zinkchlorid. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 48 Stunden. </li><li> Als nächstes fügen Sie eine Mischung aus 8 U alkalischer Phosphatase, 0,02 U phosphodiesterasE I, in 40 ul 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,9) zu Mischung Verdauung. Die Probe wird bei 37 ° C für 2 Stunden inkubiert. </li><li> Das Gemisch wird durch Zugabe von 10% iger Ameisensäure neutralisiert. </li><li> Übertragung der Probe auf eine Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfilter Vorrichtung (cutoff 3 kDa), 200 ul tridestilliertem H 2 O. Legen Sie die Ultra-Filter in den Zentrifugenrotor bei 14.000 xg für 15 min. Dann trennen Sie die Ultra Filter Gerät aus der Mikrozentrifugenröhrchen. Lyophilisieren das Enzym-freie Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 10. DNA-Probe Entsalzung vor der Analyse <ol><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) nach bekannten Bedingungen. 6 </li><li> Lösen des lyophilisierten verdaute DNA in 20 ul H 2 O und injizieren in HPLC-UV. </li><li> Sammeln der Probe in einem Fläschchen nach dem Salzelution (erste Minuten) und gerade vor der Elution time des ersten Nucleosids (5&#39;R-cdGuo), bis zum Ende des chromatographischen Programm. </li><li> Die Probe wird lyophilisiert und resolubilisiert in 20 ul Wasser. </li></ol> 11. LC-MS/MS Quantitative Analysis <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-MS/MS (Triple-Quadrupol), bevor die Analyse durch das Laden der analytischen Methode und das Verfahren für den MS-Detektor (ESI). 6 </li><li> Fügen Sie 1 ul der Isotopen-markierten Verbindungen Mischung in der Probe im Verfahren 7 vorbereitet. </li><li> Inject 20 ul der spiked verdaut DNA-Lösung in destilliertem Wasser. </li><li> Die erhaltenen chromatographischen Daten werden auf der Grundlage der bisherigen Kalibrierung mit Referenz-Verbindungen erarbeitet. Eine repräsentative HPLC laufen mit Adenosin und Guanosin-2&#39;-Desoxyribonukleoside und ihre oxidative und Cyclo-Derivaten ist in Abbildung 11 dargestellt. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Umwandlung der natürlich vorkommenden cis ungesättigten Fettsäuren auf geometrische trans-Isomere ist eine Transformation mit der Produktion von radikalen Spannung in der biologischen Umgebung verbunden. Zellmembran Lipide, die Fettsäuren enthalten, sind ein relevanter biologische Zielstruktur für radikale Stress und wir zuerst die endogenen cis-trans-Isomerisierung Phospholipide in Zellkulturen, Tieren und Menschen Beurteilung analytische Protokolle in jedem Fall. 8-10 Wir haben gezeigt, dass diese Transformation kann durch eine Vielzahl von S-haltige Verbindungen, darunter Thiole, Thioether und Disulfide, die unter verschiedenen Rest Stressbedingungen können Thiylradikalen erzeugen, dh das Isomerisieren Mittel (Figur 3) eintreten. Das Beispiel in diesem Artikel gezeigt, konzentriert sich auf die Klasse von Cholesterylestern, die einen bekannten Bruchteil Plasmalipide, streng in Lipoprotein-Metabolismus beteiligt repräsentieren. Die Esterbindung zwischen Fettsäuren und choCholesterin wird durch die Übertragung von Fettsäuren von der Position 2 des Glycerineinheit von Phosphatidylcholin zu Cholesterin, ein Schritt durch das Enzym Lecithin Cholesterin Acyl Transferase (LCAT) katalysiert biosynthetisiert. Daher werden Plasma Cholesterylestern strikt Membranlipid Umsatz verbunden und enthalten relativ hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) typischerweise in Phosphatidylcholinen, dh Linolsäure und Arachidonsäure. Lipoprotein Bildung wird in kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen beteiligt sind. Die Reaktivität von natürlichen Cholesterylestern mit freien Radikalen kann an den Doppelbindungen Linoleat und Arachidonat-Reste, die in den entsprechenden trans geometrische Isomere umgewandelt werden (siehe Abbildung 1 für die Strukturen) auftreten. Charakterisierung des trans Cholesterylester Gehalt in biologischen Proben ist interessant für Biomarkerentwicklung. Eine indirekte Methode besteht aus der Umwandlung von cholesteryl Ester aus Plasma zu den entsprechenden Fettsäure-Methylester (FAME) und Abtrennung durch gaschromatographische Protokollen isoliert. In diesem Fall wird die Kalibrierung der Standardwerken der cis-und trans-Fettsäuremethylester durchgeführt, um die Quantifizierung der trans-Gehalt in den Proben zu erlauben. Basierend auf den analytischen Studien über die Cholesterylester-Bibliothek durchgeführt wird, haben wir vorgeschlagen, um auch dann eine Methode auf Basis von Raman-Spektroskopie, die durchgeführt werden können direkt auf der Cholesterylester Fraktion aus Plasma isoliert durchgeführt, ohne weitere Derivatisierung zur entsprechenden FAME (siehe Abbildungen 2 und 9). Es ist erwähnenswert, dass bis heute keine erfolgreiche Methoden zu trennen cis-und trans-Isomere der Fettsäure mit Lipiden durch HPLC, wie stattdessen durch Cholesterylester Hydroperoxide beschrieben werden beschrieben. Bisher ist die indirekte Methode der Gaschromatographie immer noch die beste verfügbare Methode so weit. Nach diesem Verfahren der erste quantitative evaluiertation des Mono-trans-Gehalt von Cholesterylestern aus Plasma von gesunden Probanden isoliert abgeleitet bereitgestellt. Mit Flammenionisationsdetektor (FID) die Grenze der Nachweisbarkeit ist zufriedenstellend (ppb) und nanomolaren Mengen der Verbindungen nachgewiesen wurden. 5. Mit verschiedenen Detection-Systeme kann diese Grenze sogar gesenkt werden. Die Wirkung von ionisierender Strahlung auf Cholesterylestern ist Materie weiterer Studien, ob ein lineares Ansprechverhalten relativ zu der applizierten Dosis erhalten wird. Als ein zweites Beispiel, wählten wir modifizierten Nukleoside, die durch freie Radikale verursachten Schäden der DNA erzeugt werden kann. Hydroxylradikale (HO •) sind dafür bekannt, die meisten schädlichen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf ihre Fähigkeit zur chemischen Modifikationen an DNA verursachen. Einzelne oder mehrere Läsionen können auf DNA vorkommen, dass in eukaryotischen Zellen ist in Kern und Mitochondrien. Identifizierung und Messung der wichtigsten Klassen von oxidative erzeugten Schäden an DNA erfordern die approprIATE molekularen Bibliotheken, um die Einrichtung der analytischen Protokolle. Wir konzentrieren uns auf den kleinsten Interesse Tandem Läsionen, die Purin 5 sind &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden, mit einem zusätzlichen kovalenten Bindung zwischen der Basis und der Zuckerreste durch den Angriff freier Radikale erzeugt. Die Verbindungen sind 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin und 5&#39;-,8-cyclo-2 &#39;-desoxyguanosin in den bestehenden 5&#39;R und 5&#39;S diastereomeren Formen (Abbildung 5). Ihr Potenzial zur freien Radikalen Stress-Marker geworden ist Sache der Grundlagenforschung. 2 der Tat, wenn DNA HO ausgesetzt ist • radikalen Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position des Zuckers ist eine der möglichen Ereignisse, die zur Entstehung dieser Tandem-Läsionen. Purin 5 &#39;,8-cyclonucleosides kann als Summe von Diastereomeren durch HPLC-MS/MS in enzymatisch verdaut γ-bestrahlten Proben DNA Variieren 1 bis 12 Läsionen / 10 6 Nukleoside / Gy messenden gehen Form in Abwesenheit von Sauerstoff zu physiologischen Niveau von Sauerstoff ichn Gewebe, das Diastereomerenverhältnis 5&#39;R / 5 Seins ~ 4 und ~ 3 für 5 &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdGuo bzw. (Abbildung 11). 11 Es ist erwähnenswert, dass die Beziehung zwischen Strahlendosis und 5 &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdAdo Läsionen in der zellulären DNA nachgewiesen ist bei weitem nicht verstanden. Die einzigen Experiment auf 2kGy Bestrahlung basiert berichtet in der experimentellen kann nicht als schlüssig angesehen werden. 11 Weitere Versuche dieser Art und analytische Quantifizierung der vier Läsionen sind für die Festlegung solcher Zusammenhang. Der Nachweis dieser Läsionen und die populäreren oxidativen Transformationen (z. B. 8-oxo-2&#39;-desoxyguanosin, 8-oxodGuo) sind Gegenstand intensiver Untersuchungen, ausweisend die Bedeutung beider Läsionen während oxidativen Stoffwechsels. 6,13 Die Verwendung von HPLC -MS/MS (Triple-Quadrupol) eine Nachweisgrenze nahe 30fmol für alle vier Läsionen. Letzte Verbesserungen behauptet Nachweisgrenzen attomol Ebenen durch das Instrument produ erreichenCERs. Basierend auf der jüngsten Literatur, haben 6 analytischen Verfahren zur ordnungsgemäßen Reinigung der Probe und Bereicherung sind, um die Nachweisgrenzen des MS / MS / MS (ion trap) oder des MS / MS (Triple-Quadrupol) verwendet zu erfüllen in unserem Fall. Bioinspirierte Syntheseverfahren der Verbindungen 1-4 wurden entwickelt ausgehend von 8-Derivate unter bromopurine oder Photolyse. 7,12 Diese Verfahren beinhalten einen Rest Kaskadenreaktion, die DNA-Schäden Mechanismus der Bildung von 5 nachahmt &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdGuo Läsionen. Aus biologischen Perspektiven, wurde festgestellt, dass diese Läsionen mit zunehmendem Alter bei einer Gewebe-spezifischen Art und Weise (Leber&gt; Niere&gt; Gehirn) ansammeln, was beweist, dass DNA-Reparaturmechanismen unzureichend, um das genetische Material aus dieser Läsionen zu bewahren sind. 13 Tatsächlich Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ist der einzige Weg zur Zeit für die Reparatur dieser Läsionen identifiziert. 2 Die Zwei-Klassen-es von Verbindungen in den Abbildungen 1 und 5 dargestellt sind nicht im Handel verfügbar im Moment, aber von den Synthesestrategien in der Literatur beschrieben wäre es nicht schwierig sein, diese Verbindungen für den kommerziellen Einsatz vorbereiten. Der multidisziplinäre Ansatz von chemisch-biologische Studien zur Verfügung gestellt hat nicht nur einen enormen Wert in der Identifikation von neuen Mechanismen vorkommende in der biologischen Umgebung, sondern gibt auch einen wesentlichen Beitrag zur Entdeckung neuer Biomarker und Diagnostik, letztendlich bringt Neuheit im Gesundheits-und Präventionsstrategien. 14 Der chemische Beitrag wird für eine erfolgreiche Entwicklung der molekularen Medizin benötigt, Schaffung integrierter Plattformen und Platten für Metabolic Profiling, die voraussichtlich für eine optimale Rationalisierung der Intervention Design, entweder therapeutische und Ernährung, wodurch Unsicherheiten und Fehler, wenn sie sein können vorhersehbare ermöglichen werden.

Die Reaktivität von freien Radikalen zeigte seine enorme Bedeutung für viele biologische Vorgänge, einschließlich der alternden Gesellschaft und Entzündungen. Heutzutage ist es mehr und mehr deutlich, dass die Klärung der einzelnen chemischen Schritt in diese Reaktivität beteiligten benötigt wird, um die zugrunde liegenden Mechanismen und sehen wirksame Strategien zur Bekämpfung freier Radikale und Reparatur des Schadens zu verstehen. Der Beitrag aus der chemischen Studien ist von grundlegender Bedeutung, aber die direkte Untersuchung in der biologischen Umgebung kann schwierig sein, da die Überlagerung verschiedener Prozesse kompliziert und stört die Prüfung der Ergebnisse und die damit verbundenen Schlussfolgerungen. Deshalb hat sich die Strategie der Modellierung Radikalreaktionen unter biologisch verwandten Erkrankungen zu einem grundlegenden Schritt in der Erforschung der chemischen Mechanismen in der Biologie. In den letzten zehn Jahren unserer Gruppe entwickelten Modelle der radikalischen Prozesse unter biomimetischen Bedingungen. Insbesondere haben wir envisaged biologisch relevanten Transformationen von ungesättigten Fettsäuren, Nukleoside und schwefelhaltigen Aminosäuren und sie in der Spur zu bewerten und als Biomarker für den Gesundheitszustand validiert werden. 1-4 Unsere allgemeine Ansatz besteht aus drei Modulen: <ul><li> Organischen Synthese, die den Zugang zu entsprechend modifizierten Biomolekülen zur Verfügung stellt. Das synthetische Plan kann auch so ausgebildet sein, um die freie Radikale ablaufenden Prozesse in der biologischen Umgebung zu simulieren, damit die Anwendung von Bedingungen in der Lage, den biologischen Prozess von Interesse, die das Prinzip der biomimetischen Radikalchemie simulieren. In biomimetischen Modellen das Reaktionsmedium Wasser oder ein heterogenes Medium aufgrund der Koexistenz von hydrophilen und hydrophoben Kompartimenten. Der Vorteil mit biomimetischen Modellen arbeiten, ist eine vereinfachte Umgebung mit bekannten Reaktionspartner, wo Reaktivität und Produkte in mehr Details untersucht werden können, haben, möglicherweise entdeckenneue chemische Wege. Von diesem Schritt mechanistische und kinetische Informationen können gesammelt werden; </li><li> Reinigung, Analyse und Charakterisierung der Produkte, eine strukturelle und chemische Daten der modifizierten Biomolekülen um molekularen Bibliotheken anzuordnen und zu erleichtern recognition.in die komplexeren biologischen Umgebung. Protokolle werden auch im Hinblick auf die Lösung komplexe Mischungen von Verbindungen, wie die aus biologischen Proben abgeleitet etabliert; </li><li> Biomarker-Entwicklung mit biologischen Proben, entweder durch in vitro Experimente mit Zellkulturen und in vivo Studien von Tieren und Menschen. Die Protokolle in biomimetischen Modelle entwickelt werden dann der komplexe Analysen von Proben angewendet, um die freien Radikale Transformationen unter verschiedenen Bedingungen vorstellbar. Molecular Libraries durch Synthese entwickelten eine enorme Hilfe, um Life-Science-Entdeckungen. Die gesammelten Informationen auf dem freien radikalen Transformationen give die Möglichkeit, herauszufinden, Reparatur-und Präventionsstrategien. Datenbanken der Ergebnisse kann eine sorgfältige Beurteilung durch multivariate Analyse der Biomarker Bedeutung so gut wie möglich assoziierten Faktoren verwendet werden. </li></ul> Wir entschieden uns für zwei Klassen von relevanten Biomarkern, diesen Ansatz zu akkreditieren: Cholesterylestern und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleoside.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>MATERIALS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl linoleate &ge;98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0289-100 mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl arachidonate&ge;95% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C8753-25mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M6250-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-propanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34965-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Methanol 215 SpS </td>
 <td>Romil</td>
 <td> H409-2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>02860-2.5L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Chloroform SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H135 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> n-Hexane 95% SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td> H389 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetonitrile 230 SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H047 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Dichloromethane SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H2022,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Carbon tetrachloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>107344-1L </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Diethyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td> 309966-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S7653-5KG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaOH solid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221465-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NH4OH sol. 28%-30%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221228-1L-A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320099-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221759-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Molybdate tetrahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A7302-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sulfuric Acid 95%-98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320501-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Silver Nitrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>209139-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium sulfate anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>238597-500G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nuclease P-I from penicillium citrinum</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N8630-1VL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase II type I-sa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P9041-10UN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E114-25MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphatase alkaline type VII-t from*bov</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P6774-1KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase I type VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P3134-100MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonuclease II type IV from*porcin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D4138-20KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Trizma(r) base, biotechnology performanc ce</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T6066-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1644-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Succinic acid bioxtra</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3674-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5670-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Formic acid, 98 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>06440-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC500324</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyguanosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3290-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyadenosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3300-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3899-CA-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3895-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nitrous oxide (N2O) </td>
 <td>Air Liquide </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonucleic acid from calf thymus</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D4522-5MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60Co-Gammacell</td>
 <td>AECL- Canada </td>
 <td>220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immersion well reaction medium pressure 125 watts </td>
 <td>Photochemical reactors ltd</td>
 <td>Model 3010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Evaporating flask 250 ml</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luna 5 &mu;m C18(2) 100 &Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>00A-4252-E0 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 &mu;m</td>
 <td>Grace</td>
 <td>88081</td>
 <td>Semipreparative</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SecurityGuard Kit</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>KJ0-4282</td>
 <td>Analytical holder kit and accessories</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Holder for 10.0 mm ID cartridges</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7220</td>
 <td>Semipreparative holder </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.0 mm ID cartridges </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7221 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-performance liquid chromatography (HPLC) </td>
 <td>Agilent</td>
 <td>1100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LC/MS/MS </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4000QTRAP System</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tandem mass ESI spectrometer </td>
 <td>(Bruker Daltonics) </td>
 <td>Esquire 3000 plus </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 2-4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27517</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>

free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development

Die Einbeziehung von freien Radikalen in den Biowissenschaften hat ständig mit der Zeit erhöht, und hat zu mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen in Verbindung gebracht. Dieses Thema umfasst verschiedene wissenschaftliche Bereiche, angefangen bei physikalischen, biologischen und Bioorganische Chemie, Biologie und Medizin, mit Anwendungen auf die Verbesserung der Lebensqualität, Gesundheit und Altern. Multidisziplinäre Fähigkeiten sind für die umfassende Untersuchung der vielen Facetten des radikalen Prozesse in der biologischen Umwelt und chemische Wissen spielt eine entscheidende Rolle bei der Enthüllung grundlegenden Prozesse und Mechanismen erforderlich. Wir entwickelten eine chemische Biologie Ansatz in der Lage, freie Radikale chemische Reaktivität mit biologischen Prozessen zu verbinden, die Informationen über die Reaktionswege und Produkte. Der Kern dieses Ansatzes ist das Design der biomimetischen Modellen Biomolekül Verhalten (Lipide, Nukleinsäuren und Proteine) in wässrigen Systemen zu studieren, erhalten Einblicke in die Reaktionswege sowie eins Aufbau molekularen Bibliotheken der radikalischen Reaktionsprodukte. Dieser Kontext kann erfolgreich zur Entdeckung von Biomarkern verwendet werden, und Beispiele sind mit zwei Klassen von Verbindungen bereitgestellt: mono-trans Isomeren von Cholesterylestern, welche synthetisiert und verwendet werden als Referenz für die Detektion im menschlichen Plasma und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2 &#39;-Desoxyribonukleosiden, hergestellt und als Referenz in dem Protokoll für den Nachweis solcher Läsionen in DNA-Proben, nachdem ionisierende Strahlungen oder erhalten von verschiedenen Erkrankungen.

Isomerisierungsverfahren wurde insbesondere für Cholesterylestern Plombierung die Mono-trans Isomeren von Linolsäure und Arachidonsäure in 1 als den ersten Produkten dieses Angriffs gezeigt, die unter Bedingungen der radikalischen Spannung in der biologischen Umgebung auftreten beschrieben. 5 In Abbildung 3 ist die chemische Mechanismus in der cis-trans Doppelbindungsisomerisierung beteiligt gezeigt. Die radikale Quelle wird in einer generischen Weg zur S-zentrierte Radikale leisten angegeben. In den beschriebenen Protokolle der radikale Quelle ist UV-Licht, können homolitically brechen die SH-Bindung in der Thiol-Molekül RSH ist. Abbildung 4 fasst die drei Schritte Protokoll für die Synthese des modifizierten Lipidklasse und ihr Nachweis im menschlichen Plasma: Die Synthese stellt eine biomimetische freie Radikale Prozess und bietet auch eine Ein-Topf komfortable Eingabe der geometrischenrische Isomere, ohne Verunreinigung durch Stellungsisomere gefolgt von Reinigung und Isolierung Protokolle. Mehrere analytischen Methoden können für eine hochempfindliche Nachweis des trans Isomerengehalt und Charakterisierung des Mono-trans Cholesterylester Bibliothek angewendet werden. Insbesondere kann der Raman-Spektroskopie direkt auf dem Cholesterylester Bruchteil durchgeführt werden, ohne Derivatisierung (siehe Abbildung 2 und Abbildung 9). Das zweite Beispiel betrifft Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden, die DNA-Läsionen durch den Angriff freier Radikale auf die Position C5 &#39;des Zuckerteils und anschließende Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Zucker und der Basis geschaffen sind Reste. Vier Strukturen hergestellt werden können, das heißt, 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin und 5&#39;-,8-cyclo-2 &#39;-Desoxyguanosin, sowohl in den bestehenden 5&#39;R und 5&#39;S diastereomeren Formen (Abbildung 5). In Abbildung 6 ter Reaktionsmechanismus gezeigt wird, beinhaltet, dass die Photolyse von 8-bromopurine Derivate 5 zu den entsprechenden C8 Radikal 6, das intramolekular abstrahiert ein Wasserstoffatom von der C5-Position selektiv BIETEN die 2&#39;-deoxyadenosin-5&#39;-yl-Rest 7. Radical 7 cyclisiert mit einer Geschwindigkeitskonstante im Bereich 10 5 -10 6 s -1, 2, gefolgt von Oxidation des Heteroaromat 8 geben die Endprodukte 9. Die Reaktion von Hydroxyl-Radikalen, durch Radiolyse von Wasser erzeugt, mit 2&#39;-Desoxyadenosin, 2&#39;-Desoxyguanosin (10) wurde gefunden, dass ca. auftreten. 10% Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position. 7 Unser Ansatz zur chemischen Biologie der Bibliotheken von Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden (einschließlich markierte Verbindungen) ist in Abbildung 7 dargestellt, mit der Identifizierung dieser Läsionen in Oligonukleotide sowie in DNA-Proben aus va erhalteneschiedenen Quellen, wie sie beispielsweise unter ionisierender Strahlung Bedingungen behandelt, wie imitieren radikaler Stressbedingungen. In Abbildung 8 ein typisches Photoreaktor Gerät sichtbar ist. Das Gerät erlaubt die Bestrahlung von Verbindungen in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst. Es besteht aus: i) der Reaktionskammer mit dem Einlass für das Inertgas (unten) und zwei Einlässe für den Gasaustritt sowie für die Reagenzien zusätzlich ausgestattet, ii) eine innere Kammer, die die geeignete Quecksilberlampe an ein Kühlsystem angeschlossen und die elektrische Leistung, die in die Reaktionskammer durch einen Glasfuge eingesetzt ist. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mono-trans-Isomere von Cholesteryl Linoleat und Arachidonat. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cholesterylestern in humanem Serum und direkte Analyse für Mono-trans Isomeren durch Raman-Spektroskopie. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Additions-Eliminierungs-Prozess, der führt zum cis-trans-Isomerisierung von Doppelbindungen durch Thiylradikale. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Drei Schritte-Protokoll für die Entwicklung von Mono-trans Cholesterylestern als Biomarker von freien Radikalen Stress. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Die vier Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonucleosid Diastereoisomere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> Abbildung 6. Erzeugung C5 &#39;Reste, entweder durch Photolyse von 5 oder durch Umsetzung von 10 mit HO • Radikale, und dem Mechanismus der Purin 5&#39; ,8-cyclo-2 &#39;Desoxyribonucleosid Formation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">Klicke hier größere Figur anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Protokoll foder Identifizierung von einigen radikalen-basierten DNA-Läsionen; mtDNA: mitochondriale DNA, nDNA: nuclear DNA. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Photochemischen Reaktor. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="Abbildung 9" /> Abbildung 9. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester. Im Einschub dem Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Cholesteryl Mono-trans Linolsäureisomeren. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="Abbildung 10" /> Abbildung 10. Vertreter GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten. <img alt="Abbildung 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;strong&gt; Abbildung 11. Repräsentative HPLC laufen mit 2&#39;-Desoxyadenosin und 2&#39;deoxyguanosine zusammen mit ihren oxidative und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribo Nucleoside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

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Alkene Structure and Reactivity

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20.1K Aufrufe.  Consiglio Nazionale delle Ricerche. Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Serie: Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Forschung

Chemie

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high surface area microporous materials, such as metal-organic frameworks (MOFs), unique challenges present themselves for PECVD treatments. Herein the protocol for development of a MOF that was previously unstable to humid conditions is presented. The protocol describes the synthesis of Cu-BTC (also known as HKUST-1), the treatment of Cu-BTC with PECVD of perfluoroalkanes, the aging of materials under humid conditions, and the subsequent ammonia microbreakthrough experiments on milligram quantities of microporous materials. Cu-BTC has an extremely high surface area (~1,800 m2/g) when compared to most materials or surfaces that have been previously treated by PECVD methods. Parameters such as chamber pressure and treatment time are extremely important to ensure the perfluoroalkane plasma penetrates to and reacts with the inner MOF surfaces. Furthermore, the protocol for ammonia microbreakthrough experiments set forth here can be utilized for a variety of test gases and microporous materials.

Herein the procedures for plasma enhanced chemical vapor deposition of perfluoroalkanes on microporous materials such as metal-organic frameworks to enhance their stability and hydrophobicity are described. Furthermore, breakthrough testing of milligram quantities of samples is described in detail.

Herstellung von hydrophoben Metall-organische Gerüste über Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition von Perfluoralkanen für die Beseitigung von Ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Eine inverse Analyse Ansatz zur Charakterisierung von chemischen Transport in Farben

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

Von Molekülen zu Materialien: neue ionische Flüssigkristalle durch Halogen-Bonding Technik

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

One-pot Microwave-assisted Conversion of Anomeric Nitrate-esters to Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate glycosyl donor. Following azido-nitration of a glycal, the product 2-azido-1-nitrate ester can be hydrolyzed under microwave-assisted irradiation. This transformation is usually achieved using strongly nucleophilic reagents and extended reaction times. Microwave irradiation induces hydrolysis, in the absence of reagents, with short reaction times. Following denitration, the intermediate anomeric alcohol is converted, in the same pot, to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate.

A 2-azido-1-nitrate-ester can be converted to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate in a one-pot procedure. The goal of the manuscript is to demonstrate utility of the microwave reactor in carbohydrate synthesis.

Ein-Topf Mikrowellen-gestützte Umwandlung des Anomeric Nitrat-Ester und Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...