Saccharibakterien sind obligate Parasiten, die eine Kokultur mit geeigneten Wirtsbakterien erfordern. Als menschliche orale Saccharibakterien können für die meisten Individuen leicht isoliert werden, indem bekannte Wirtsbakterienarten verwendet werden. Dieses Protokoll ermöglicht es jedem Forscher oder Labor, seine eigenen Stämme in binärer Co-Kultur zu isolieren.
Diese Technik verwendet einfache Geräte und Geräte, die in den meisten mikrobiologischen Labors vorhanden sind, und wurde erfolgreich zur Kultion von über 30 Isolaten eingesetzt, die sechs Arten von Sacchararibakterien repräsentieren. Dieses Protokoll kann für die Isolierung anderer Kandidaten-verfolgter Strahlenarten sowie von Sacchararibakterien aus verschiedenen Umgebungen und anderen Säugetieren nützlich sein, wenn geeignete actinobakterielle Wirte identifiziert und isoliert werden können. Andrew Collins, ein ehemaliger Postdoktorand in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie zunächst Kulturen von Wirtsbakterien wie Arachnia propionica, mit genügend Zeit, um in die frühe stationäre Phase zu wachsen. Um die Kultur zu initiieren, impfen Sie zwei bis fünf Milliliter tryptische Sojabrühe mit 0,1% Hefeextrakt mit Arachnia propionica und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Als nächstes montieren Sie Filterhalter mit schienengeätzten 0,2-Mikrometer-Filtermembranen.
Wickeln Sie sie in Folie und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren zusammen mit Zentrifugenröhrchen und Kappenbaugruppen. Sterilisieren Sie zusätzliche Vorräte bei versehentlichem Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen. Sammeln Sie Zahnbelag, indem Sie entlang des Zahnfleischrands, mit einem sterilen Papierpunkt, einer Anmutskurette oder einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze kratzen und in einen geeigneten Puffer wie MRD oder PBS überführen.
Halten Sie die Probe auf Eis, bis Sie bereit sind, fortzufahren. Resuspendieren Sie den Zahnbelag energisch mit einer Kombination aus Wirbeln und Pipettieren mit einer kleinen Pipettenspitze und geben Sie dann die resuspendierte Plaqueprobe in ein Röhrchen mit neun Millilitern MRD-Puffer. Eine sterile Filterbaugruppe mit aseptischer Technik vorsichtig auspacken.
Drehen Sie eine Vierteldrehung ab und ziehen Sie den Filterhalter wieder fest, um sicherzustellen, dass die Fäden richtig eingerast sind und das Gerät ordnungsgemäß geschlossen ist. Waschen Sie die Membran, indem Sie 10 Milliliter MRD-Puffer mit einer Spritze durch das Gerät geben. Um die Probe auf den gewaschenen Filter aufzutragen, entfernen Sie den Kolben aus einer Spritze und befestigen Sie ihn an der Filtervorrichtung.
Legen Sie ein steriles Zentrifugenröhrchen unter diese Filtervorrichtung, um das Filtrat aufzufangen, gießen Sie dann die dispergierte Zahnprobe in die Spritze und laden Sie sie auf den Filter. Dann wenden Sie leichten Druck auf den Kolben an, um die Probe durch den Filter zu drücken. Waschen Sie die Membran mit weiteren 10 Millilitern MRD-Puffer und sammeln Sie den Durchfluss im selben Röhrchen wie die gefilterte Probe.
Dann den Schlauch aseptisch verschließen und auf Eis halten. Machen Sie eine Orientierungsmarkierung auf dem Rohr und der Kappe, um die Position des Zellpellets nach der Zentrifugation zu identifizieren. Legen Sie das Röhrchen in eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit der Markierung auf der Oberseite und zentrifugieren Sie die Proben bei 60.000 G für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig ausgießen und das Pellet auf der Oberseite des Rohres halten. Anschließend wird das Pellet in ein bis zwei Milliliter MRD-Puffer durch kräftiges Vortexing wieder aufgeboren. Bereiten Sie Kulturröhrchen vor, indem Sie zwei Milliliter geeigneter Wachstumsmedien in die Röhrchen aliquotieren.
Dann fügen Sie 200 Mikroliter Übernachtkultur von Wirtsorganismen und 100 bis 200 Mikroliter resuspendierte gefilterte Probe zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die kombinierten Proben unter Bedingungen, die für den Wirtsorganismus geeignet sind. Passage der Zellen alle zwei bis drei Tage, indem 200 Mikroliter der binären Kultur auf zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium in einem neuen Röhrchen übertragen werden.
Wenn die durchgetretenen Kulturen bei 200 Mikrolitern nicht infizierter Wirtskultur kein Wachstum zeigen, geben Sie beim Passieren der Zellen geimpfte Röhrchen in den Inkubator zurück. Aliquote 24 Mikroliter des PCR-Masters in eine 0,2 Milliliter PCR-Röhre mischen. Legen Sie das Röhrchen an einem Mikroliter saccharibacteria-infizierter Kultur in einen Thermocycler.
Stellen Sie das PCR-Programm wie im Textmanuskript beschrieben ein. Laden und führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1%Agros-Gel aus. Ein Band von etwa 600 Basen bestätigt das Vorhandensein von Saccharibakterien.
Um die Reinheit positiver Kulturen zu bestätigen, führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der Co-Kultur von Sacchararibakterien in einem sterilen Puffer durch und verteilen Sie 100 Mikroliter auf einer Agarplatte. Inkubieren Sie die Kultur unter geeigneten Wachstumsbedingungen und beobachten Sie auf kontaminierende Organismen. Ein Band von etwa 600 Basen bestätigt das Vorhandensein von Saccharibakterien.
Der PCR-Nachweis kann in anfänglichen Infektionskulturen aufgrund einer geringen Anzahl von Sacchararibakterien-Symbionten negativ erscheinen. Nach einigen Passagen sollte jedoch ein starkes PCR-Produkt auftreten, das darauf hinweist, dass eine stabile Infektion aufgetreten ist. Das Testen mehrerer Wirtsarten mit dem gleichen Saccharibakterienfiltrat hat normalerweise eine geringe Erfolgsrate.
Da die Symbiontenwirtsinteraktion sehr spezifisch ist. Wenn die infizierten Kulturen wachsen, sollte ein normales trübes Wachstum auftreten. Wenn sich die Symbiose etabliert, erscheinen infizierte Kulturen weniger trüb als Kulturen nicht infizierter Wirtsorganismen.
Eine kontaminierte Kultur kann gereinigt werden, indem infizierte Kolonien nach dem Plattieren gepflückt werden. Infizierte Kolonien können manchmal durch eine unregelmäßige Kolonieform im Vergleich zu nicht infizierten Kolonien identifiziert werden. Der Anteil einer regulären Kolonie hängt vom Titer der Sacchararibakterien in der binären Kultur ab.
Wenn der Titer niedrig ist, erscheinen weniger Kolonien unregelmäßig, was es einfach macht, die infizierten Kolonien auszuwählen und eine reine binäre Kultur zu starten. Kulturen können für mehrere Passagen nicht positiv erscheinen. So werden einige Patienten benötigt.
Es ist auch notwendig, regelmäßig auf Kontamination von binären Kulturen zu überprüfen, da dies die Kultur destabilisieren und zum Tod der Saccharibakterien führen kann. Die binäre Kultur kann für alle Arten von Laborexperimenten verwendet werden. DNA und RNA können für die Genomsequenzierung bzw. Transkriptomanalyse extrahiert werden.
Die Pathogenität kann auch mit Tiermodellen untersucht werden.
