The authors would like to acknowledge the contribution of our colleagues Sandrine Roch-Lefevre and Eric Gregoire of the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France). This work was supported by the Government of Canada Science and Technology program at Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), the CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), the Canadian Nuclear Safety Commission and by the Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, France).

Alle Maus-Handling und Behandlungsverfahren sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Tierpflegeprogramme eingestellt und von einem lokalen Tierschutzkommission genehmigt einzuhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Zustimmung des örtlichen Tierpflege Ausschuss durchgeführt. ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Radioaktivität (einschließlich, aber nicht, um die Handhabung von Tritium, externen γ-Bestrahlung beschränkt, Umgang mit radioaktiven tierischen Geweben, Bettwäsche Abfälle) sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Strahlenschutzbehörden setzen haften und durch autorisierte durchgeführt werden, Personal in einem zertifizierten Labor und / oder Einrichtung. 1. Tier Arbeit <ol><li> Tier Grouping <ol><li> Wenn Mäuse werden von einer externen Organisation Ankunft zu akklimatisieren Tiere für mindestens 10 Tage in der Tierhaltung. Wenn die Studie enthält mehrere Behandlungsgruppen, zu gewährleisten, dass das Tier Lieferant al sendenl Tieren als eine einzige Partie. </li><li> Mäuse nach dem Zufallsprinzip zuweisen, um den Behandlungsgruppen von 10 Mäusen pro Gruppe. Bei Verwendung von männlichen Mäusen des C57BL / 6-Stamm, die Tier Lieferanten vor, arrangieren Randomisierung von sehr jungen C57BL / 6 Männern in ihrer Einrichtung zu Aggression Probleme zu mildern. </li></ol></li><li> Chronische Exposition von Mäusen auf Internal β-Strahlung <ol><li> Bereiten Sie Arbeitskonzentrationen von Tritium (10 kBq / L und 1 MBq / L) in der Maus Trinkwasser durch Verdünnen der ursprünglichen Bestand von HTO und OBT (einer Mischung aus tritiierten Prolin, Alanin und Glycin Aminosäuren) Lösungen. </li><li> Validierung der Endkonzentrationen von Tritium im Trinkwasser durch Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers. Einzustellen Konzentrationen, falls erforderlich. </li><li> Behandlung von Tieren für einen Monat durch den Zugang ad libitum an die Tritiumwasser. Wenn Wasser während der Behandlung Zeitraum von zwei Wochen zur Neige geht, fügen Sie mehr Wasser. Andernfalls ändern Flaschen auf zwei Wochen. </li><li> Treat schein-bestrahlten KontrollMäusen identisch. Halten Sie sie in einem separaten Raum &quot;sauber&quot; oder auf einem separaten &quot;sauber&quot; Rack unter Luftüberdruck, um Tritium Kreuzkontamination aus der Luft zu vermeiden. </li></ol></li><li> Chronische Exposition von Mäusen auf externe γ-Strahlung Hinweis: γ-Bestrahlungsanlage / Geräte werden je nach Standort variieren. </li><li> Verwenden von verfügbaren Methoden der Dosimetrie, bestimmen die Abstände von einem γ-Strahlungsquelle, Strahlungsfeldern die gewünschten Dosisleistungen haben. Stellen Sie sicher, Homogenität der Strahlungsfelder in den Bereichen Abdeckung der Tierkäfige. Anmerkung: 1,7 μGy / h entspricht einer Dosisrate von 1 MBq / L Tritium im Körper produziert. </li><li> Expose Mäusen, indem Mäusekäfige an den in Schritt 1.3.1 für einen Monat festgelegt Distanzen. Minimieren tägliche Unterbrechung γ-Bestrahlung 30 min. Verwenden Thermolumineszenz-Dosimeter zur Gesamtenergiedosen zu messen. </li></ol> 2. Opfer und Sampling <ol&gt; <li> Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente, 60 mm Petrischalen mit eingelegter 70-Mikrometer-Zelle Siebe, 15 ml und 1,5 ml Röhrchen, RPMI-Medium mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und Ort, die alle innerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank ergänzt. Gewährleistung der Sterilität der Arbeit ist von entscheidender Bedeutung. </li><li> Verzichtet werden 5 ml RPMI-Medium in jede 60 mm-Petrischale. </li><li> Opfern Mäusen mit Hilfe eines von der lokalen Tierschutzkommission genehmigt Verfahren. Genickbruch ist eine gute Wahl für die in diesem Protokoll beschriebenen Splenozyten-Arbeit. Wenn jedoch Blutproben für weitere Assays (beispielsweise für die MFISH, Cytochalasin Block Mikronucleus oder ein anderer gemeinsamer genetoxicity Assays) benötigt werden, verwenden intrakardiale Punktion nach der Narkose mit Isofluran. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage, mit dem Kopf nach von Ihnen entfernt. Sprühen Sie die Maus nach unten mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen die Haut nach vorne in die Harnröhrenöffnung und machen einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Dammregion. <ol&gt; <li> Von diesem Schnitt, entlang der ventralen Mittellinie, um den Brustraum abgeschnitten, wobei darauf geachtet, um die Muskelwand nur unter schneiden Sie die Haut und nicht. Präparieren Sie die Haut weg von der Mittellinie. </li><li> Fassen Sie die Bauchwand mit einer Pinzette und entlang der Mittelachse der Muskelwand zu öffnen, die Bauchhöhle geschnitten. </li></ol></li><li> Auszuschneiden die Milz durch leichtes Greifen sie mit einer sterilen Pinzette und leichtes Ziehen an sie, während gleichzeitig Wegschneiden des Bindegewebes mit einer Schere. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück von der Milz (etwa 1/10 der Milz) und in ein 1,5-ml-Tube. Schnellfrost in flüssigem Stickstoff für eine anschließende Lagerung bei -80 ° C für Ergänzungstests. </li><li> Platzieren des Restes der Milz in eine Zelle Sieb innerhalb einer 60 mm Petrischale mit 5 ml vorge verzichtet RPMI Medium. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Maus. Hinweis: Extrahiert Milz kann in 60 mm-Schalen mit Medien gehalten werden (für bis zu 2 Stunden), während der Rest der Mäuse sind sacrificed. Abhängig von der Zahl der Teilnehmer, zwischen 5 und 15 Mäuse in einem Tag verarbeitet. </li></ol> 3. Herstellung von Splenozyten-Kulturen <ol><li> Homogenisierung der Milz durch Zerkleinern in einer Zelle Sieb mit einer sterilen Pinzette mit einer gebogenen Ende. </li><li> Entfernen Sie die Zelle Sieb und Sammeln des gefilterten Zellsuspension aus der 60-mm-Schale in einen 15-ml-Tube. </li><li> Spülen Zellsieb mit 5 ml Medium, um den Rest der Zellen zu sammeln. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Pellet in 10 ml RPMI. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Pellet in 5 ml RPMI. </li><li> 4 ml der Zellsuspension in eine 25 ml Gewebekulturflasche, und einem CO 2 -Inkubator entfernen (37 ° C, 5% CO 2, 80% Luftfeuchtigkeit) </li></ol> 4. Anspruchs Bestrahlung und Befestigung <ol><li> Übertragen Sie dierestlichen 1 ml Zellsuspension aus Schritt 3.8 in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. DNA-Schäden in dieser Probe gemessen wird sowohl die Behandlung induzierte Schäden und t = 0 Datenpunkt für den Aufbau einer DNA-Reparatur-Kurve darstellen. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl). </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 300 ul TBS. </li><li> Unter Mischen auf einem Vortex bei niedriger Geschwindigkeit, fügen 700 ul von -20 ° C 100% Ethanol. Schließen Sie den Deckel und schwenken, um zu mischen. </li><li> Lagern die Proben bei -20 ° C. Splenozyten in Ethanol fixiert werden bei -20 ° C für mindestens 12 Monate lang ohne nennenswerten Verlust in der γH2AX Signal gespeichert werden. </li><li> Bestrahlen die Splenozyten-Kulturen von Schritt 3.8 mit einem herausfordernden γ-rad<html> iation Dosis von 2 Gy in einer Dosisrate ≥ 200 mGy / min unter Verwendung verfügbarer Bestrahlungseinrichtung. Anmerkung: Der Zweck dieser Bestrahlung zu DNA-DSB-Reparatur zu induzieren, um die Maschinen herauszufordern. Röntgenstrahlung kann auch für diesen Zweck verwendet werden. </li><li> Die Kulturen sofort zu einem CO 2 Inkubator zurück. </li><li> 1 Stunde nach der anspruchsvollen 2 Gy Bestrahlung, entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Um eine repräsentative Probe aliquoten sammeln, sanft resuspendieren Zellen mit einer Pipette und 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Rückgabe der Zellkulturen zu einem CO 2 -Inkubator. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5. </li><li> 24 Stunden nach der Herausforderung 2 Gy γ-Bestrahlung, Ernte und beheben bei = 24 Stunden Probe, wie in Schritt 4.8 beschrieben - 4.10. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Immunfluoreszenz-Markierung mit Anti-γH2AX Antikörper Hinweis: In der Regel 15 - können 30 Proben pro Tag immunofluorescently markiert und mittels Durchflusszytometrie in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Um einen genauen Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen zu gewährleisten, sind Probe (n) aus jeder Gruppe. Siehe auch Referenz 16 für weitere Details. <ol><li> Bereiten Sie eine markierte Satz von Rohren für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben und auf Eis. Verwenden Sie 12 x 75 mm nicht begrenzten Glasröhren. Sterilität wird nicht für diese Arbeit erforderlich. Fügen Sie eine weitere historische Kontrollprobe für die Kennzeichnung mit sekundärem Antikörper nur (&quot;nur 2. Ab&quot;). Verwenden Sie diese historische Kontrollprobe in jeder Durchflusszytometrie innerhalb einer Studie laufen. </li><li> 0,5 ml eiskaltem TBS in jedes Röhrchen. </li><li> Entfernen Sie feste Splenozyten von -20 ° C, Wirbel für 5 Sekunden und übertragen ein 0,5-ml-Aliquot auf vorbereiteten Röhrchen mit TBS. Setzen Sie den Rest der Proben zurück in -20 ° C Lagerung undhalten als Backup-Probe. </li><li> Zentrifuge Splenozyten bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TST-Puffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 ul des primären Anti γH2AX Antikörper verdünnt 1: 150 in TST-Puffer. Verwenden Sie 200 ul von TST für die &quot;2nd Ab nur&quot; Kontrollprobe. </li><li> Position Röhrchen auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einem Winkel von 45 - 60 ° C und Schütteln für 1,5 h bei 300 · g bei RT. </li><li> Während Rohre Inkubieren, bereiten ein ausreichendes Volumen (200 ul / Probe) der Ziege-anti-Maus Sekundär-Antikörper mit Alexa-488 bei einer 1 konjugiert: 200-Verdünnung in TST-Puffer. Hinweis: Alle Arbeiten, die mit Alexa-488konjugierten Antikörper (Schritte 5,10-5,16 unten) sollte unter Schwachlicht-Bedingungen durchgeführt werden und markierten Proben sollten vor Licht durch Umwickeln Rohre in Aluminiumfolie geschützt werden. </li><li> Sobald die 1,5 h Inkubation abgeschlossen ist, wird mit 1 ml eiskaltem TBS, enthaltend 2% FBS in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS, enthaltend 2% FBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 &amp; mgr; l des sekundären Antikörpers aus Schritt 5.8. </li><li> Der Proben auf einem Schütteltisch 1 h inkubieren, wie in 5.7. </li><li> 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 0,5 ml TBS, enthaltend 50 &amp; mgr; g / mlPropidiumiodid. </li><li> Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Analyse Proben auf einem Durchflusszytometer mit gerätespezifischen Protokollen 16. Lesen Sie mindestens 10.000 Zellen pro Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA/H+mice.">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li><li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes.">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li><li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+[3H]thymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism).">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li><li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses.">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li><li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data.">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li><li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection.">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks.">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+(125)IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody.">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li><li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus+on+histone+variant+H2AX:+to+be+or+not+to+be.">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li><li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy.">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids,+tumors,+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL/6J+mice.">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li><li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES(R).">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li><li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FociCounter:+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci.">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li><li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RABIT:+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage.">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li><li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice.">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li><li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+in+the+context+of+chromatin:+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy.">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li><li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays.">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li></ol>

The authors declare that there are no known competing financial interests.

Die hier vorgestellte Protokoll ist nützlich für die Durchführung von Groß Maus in vivo Studien der Prüfung der genotoxischen Wirkungen von geringen Mengen von verschiedenen chemischen und physikalischen Mitteln, einschließlich ionisierender Strahlung. Unsere einzigartige spezifischen pathogenfreien Tierhaltung mit einer GammaBeam 150 Bestrahlungs ausgestattet und eine 30 Meter lange Bestrahlungshalle ermöglicht die Durchführung lebenslangen Studien mit niedrigen oder sehr niedrigen Dosisrate Bestrahlun...

Signifikante Kontroverse über die möglichen schädlichen Auswirkungen von entweder niedrigen oder sehr niedrigen Dosen ionisierender Strahlung und die Angst vor Strahlung Öffentlichkeit, durch Bilder der Hiroshima und Nagasaki Atombombenabwürfe und seltener AKW Unfälle angetrieben (verschärft durch Massenmedien), hat zu sehr strengen Strahlenschutzverordnung und Normen, die möglicherweise wissenschaftlich begründet sind es nicht. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Berichte sowohl das Fehlen von schädlichen und das Vorhandensein von potenziell positiven biologischen Effekte von niedrig dosiertem Strahlen 1-4 induzierte dokumentiert. Der Hauptstrahlungsgesundheitsrisikofaktor ist die Wahrscheinlichkeit von Krebs, basierend auf epidemiologische Studien von Überlebenden der Atombomben Empfangen hohen oder mittleren Dosen von Strahlung geschätzt. Lineare Extrapolation dieser Daten (so genannte lineare-no-Schwelle oder LNT-Modell) verwendet wird, um Risiken von Krebs bei niedrigen Dosen zu schätzen. Allerdings hat dieser Ansatz nicht weltweiten wissenschaftlichen Akzeptanz erhaltenund ist stark umstritten 5. Es ist offensichtlich, dass weitere Studien erforderlich sind, um diese Frage zu klären und möglicherweise Strahlenschutznormen zu verbessern. Solche Studien sollten chronische Behandlungen (beste Angleichung der Umwelt- und Arbeitspositionen), in vivo-Tiermodellen (am besten für die Extrapolation Wirkungen auf die menschliche) und solchen Endpunkten als DNA-Schäden Tarife, DNA-Reparatur und Mutagenese beinhalten. Es ist bekannt, dass die DNA das primäre Ziel für Beschädigung Strahlungseffekte und unvollständige oder fehlerhafte Reparatur kann zum Mutagenese und Krebsentwicklung 6 führen. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind eines der schädlichsten Arten von DNA-Läsionen und können den Zelltod der Tumorgenese und 7 führen. Es ist daher wichtig, dass das Niveau des DSB nach Exposition gegenüber niedrigen Strahlungsdosis und / oder anderen Stressfaktoren, wie zum Beispiel chemische Schadstoffe sicher und genau zu messen. Eine der sensitiven und spezifischen MarkernDNA-DSB phosphoryliert Histon H2AX, genannt γH2AX 8 noch weitere Marker und Methoden wurden vorgeschlagen 9,10. Es wird geschätzt, dass Tausende von H2AX Moleküle in der Nähe eines induzierten DSB, sind bei der Bildung von γH2AX was den Nachweis einzelner DSB durch Immunmarkierung mit einem Anti-Antikörper γH2AX und Fluoreszenzmikroskopie 11 beteiligt. Die Antwort ist sehr schnell und erreichte ihr Maximum zwischen 30 und 60 min. Beweise vorliegen, dass γH2AX erleichtert Reparatur von DNA-DSB durch die Gewinnung von anderen Reparaturfaktoren zu den Orten der Brüche und durch Modifikation der Chromatinstruktur zu gebrochenen DNA-Enden zu verankern und den Zugang für andere Reparaturproteine ​​(in 12 überprüft). Nach Abschluss der Reparatur von DNA-DSB, γH2AX wird dephosphoryliert und / oder durchläuft Abbau und neu synthetisierten H2AX Moleküle zu ersetzen γH2AX in den betroffenen Bereichen des Chromatins 10. Überwachung Bildung und Verlust der γH2AX können,liefern daher eine genaue Schätzung der DNA-DSB-Reparatur-Kinetik. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Reparatur von DSB in verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien mit hohen Dosen von Strahlung und deren Geschwindigkeit und Rest DSB Niveaus bestrahlt wurde gezeigt, dass mit radiosensitivity 13-15 korrelieren studieren. Modifizierten wir dieses experimentellen Ansatzes und wendeten sie auf eine in vivo-Maus-Studie die Wirkung von niedrigen Dosen von chronischen γ- und β-Bestrahlung auf DNA-DSB-Reparatur-Ebenen und (1) zu untersuchen. Erstens, zeigen wir ein Verfahren, um einen langfristigen chronischen Exposition von Mäusen durchgeführt, um β-Strahlung entweder durch Tritium emittierte (Wasserstoff-3) in Form von tritiiertem Wasser (HTO) oder organisch gebundenem Tritium (OBT) gelöst im Trinkwasser . Die beiden Formen werden voraussichtlich zu akkumulieren und / oder anders im Körper und somit zu verteilen, erzeugen unterschiedliche biologische Wirkungen. Beide Formen sind potentielle Gefahren in der Nuklearindustrie. Diese Behandlungdurch chronische Einwirkung von γ-Strahlung in einer äquivalenten Dosis Rate parallel um einen korrekten Vergleich der beiden Strahlungsarten, die entscheidend für die Bewertung der relativen biologischen Wirksamkeit zu ermöglichen. Beta-Strahlung von Elektronen zusammengesetzt ist, so dass es sehr verschieden von der γ-Strahlung, Hochenergiephotonen. Aufgrund dieses Unterschieds Β-Strahlung stellt hauptsächlich Innen Gefahr für die Gesundheit und können unterschiedliche biologische Wirkungen im Vergleich zu γ-Strahlung zu erzeugen. Diese Komplikation zu erheblichen Kontroversen über die Regulierung der Einwirkung von β-Strahlung, die von HTO emittiert. So Regulierungsebenen HTO im Trinkwasser für die Öffentlichkeit variieren von 100 Bq / L in Europa zu 75.000 Bq / L in Australien. Es ist daher wichtig für die biologische Wirkung von HTO um äquivalente Dosen von γ-Strahlung zu vergleichen. Zweitens, die Rate der DNA-DSB wird in isolierten Splenozyten nach Beendigung der chronischen Exposition mit immunofluorescently markierten γH2AX erkennen gemessendurch Durchflusszytometrie ed. Dies erlaubt die Bewertung des Ausmaßes der DNA-Schädigung durch die in vivo Exposition zugefügt. Allerdings ist es sinnvoll, zu erwarten, dass solche eine niedrige Belastung möglicherweise nicht produzieren keine nachweisbaren Raten von DNA-DSB; statt, einige versteckte Änderungen / Reaktionen zu erwarten, dass die Fähigkeit der Zellen auf DNA-Schäden reparieren beeinflussen würde. Diese Veränderungen, falls vorhanden, kann entweder stimulierend (Herstellung eines nützlichen Effekt) oder inhibierende (Herstellung eines schädlichen Effekt). Das vorgeschlagene Protokoll erlaubt, bei der diese Änderungen durch die Herausforderung der entnommenen Milzzellen mit einer hohen Dosis an Strahlung, die eine erhebliche Menge an Schaden entsteht (zB 2 Gy Herstellung etwa 50 DNA-DSB pro Zelle oder eine. 3 - 5-fachen Zunahme der Gesamt γH2AX Ebene) . Anschließend wird die Bildung und den Verlust der γH2AX, was die Initiierung und Abschluss der DSB-Reparatur wird mittels Durchflusszytometrie kontrolliert. Auf diese Weise kann nicht nur die basale und Behandlung induzierten Niveaus von DNA-DSB gemessen werden, sondernauch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zellen zu reagieren und Reparatur DNA-Schäden, die durch viel höhere Stressniveaus induziert.

<table><tbody><tr><td>HTO: tritiated water, [3H]</td><td>locally obtained from a nuclear reactor&amp;nbsp;</td><td></td><td>stock activity 3.7 GBq/mL;&amp;nbsp; can be substituted with HTO from Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>tritiated water, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>substitute for HTO of local origin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GammaBeam 150 irradiator</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>locally manufactured</td><td>can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anti-gH2AX antibody, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies (formerly Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P006-EAAN</td><td>500 ml bottles Absolute Ethanol</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td><td>microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>sterile polypropylene centrifuge tubes</td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm uncapped glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>disposable borosilicate glass tubes with plain end</td></tr><tr><td>T25 flasks</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340)</td></tr><tr><td>scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner scissors 12 cm sharp/sharp</td></tr><tr><td>forceps, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>Semken forceps 13 cm, straight</td></tr><tr><td>forceps, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Narrow Pattern forceps 12 cm, curved</td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>cell strainers, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Falcon cell strainers 50/case</td></tr><tr><td>PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td></tr><tr><td>TBS recipe: to make 10x stock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Sodium Chloride</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Potassium Chloride</td></tr><tr><td>Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring dna damage and repair in mouse splenocytes after chronic in vivo exposure to very low doses of beta- and gamma-radiation

Niedrig dosierte Strahlenbelastung kann eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, die in Menge und Qualität von den durch hohe Strahlendosen hergestellt Effekte unterschiedlich sind zu produzieren. Auf Fragen zu Umwelt-, Arbeits- und Gesundheitssicherheit in der richtigen und wissenschaftlich fundierte Weise bezogen in hohem Maße von der Fähigkeit, die biologischen Effekte von niedrig dosiertem Schadstoffe wie ionisierende Strahlung und chemische Substanzen genau zu messen. DNA Schädigung und Reparatur sind die wichtigsten Frühindikatoren für Gesundheitsrisiken aufgrund ihrer potentiellen langfristigen Folgen, wie zum Beispiel Krebs. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von chronischen in vivo Exposition gegenüber niedrigen Dosen von γ- und β-Strahlung auf DNA-Schädigung und Reparatur in Mäusemilzzellen studieren. Verwendung eines allgemein akzeptierten Marker der DNA-Doppelstrangbrüche, phosphoryliert Histon H2AX genannt γH2AX zeigen wir, wie es verwendet werden kann, um nicht nur das Niveau der DNA-Schädigung zu beurteilen, sondern auch Änderungenin der DNA-Reparatur-Kapazität möglicherweise durch geringe Dosis in vivo Aufnahmen produziert. Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle, genaue und zuverlässige Messung der immunofluorescently markierten γH2AX in einer großen Anzahl von Proben. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur kann, indem extrahierte Milzzellen zu einer Herausforderung Dosis von 2 Gy, eine ausreichende Anzahl von DNA-Brüche zu erzeugen, um die Reparatur auslösen und durch Messung der induzierten (1 h nach der Bestrahlung) und Rest DNA-Schäden (ausgewertet werden 24 Stunden nach der Bestrahlung). Rest-DNA Schaden würde auf unvollständige Reparatur und die Gefahr von Langzeit genomische Instabilität und Krebs. In Kombination mit anderen Assays und Endpunkte, die sich leicht in solchen Untersuchungen in vivo (beispielsweise Chromosomenaberrationen, Mikronuclei Frequenzen im Knochenmark von Retikulozyten, Genexpression, etc.) gemessen werden können, ermöglicht diese Vorgehensweise eine genaue und Kontext Evaluierung der biologischen Wirkungen von Stressoren niedrigen Niveau.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die Durchflusszytometrie Graphen für Splenozyten erwartet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Zellen werden zunächst auf Basis des &lt;elektronische Lautstärke-Seitenstreuung&gt; Streudiagramm gated (2A und 2D; elektronische Band ist gleichbedeutend mit Vorwärtsstreuung). FL3 / Propidiumiodid Histogramme (2B und 2E) bestätigen normalen Zellzyklus-Verteilung. Bedeuten ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation at JoVE.com

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

11.0K Aufrufe.  Canadian Nuclear Laboratories. A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented. 

Serie: Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Forschung

Krebsforschung

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetik

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biotechnik

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Immunologie und Infektion

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, including cancer. The cell is, therefore, provided with complex mechanisms to repair DSBs, and these pathways involve histone H2AX in its phosphorylated form at Ser-139 (namely &#947;H2AX) and p53 binding protein 1 (53BP1). As both proteins can form foci at the sites of DSBs, identification of these markers is considered a suitable method to study both DSBs and their kinetics of repair. According to the molecular processes that lead to the formation of &#947;H2AX and 53BP1 foci, it could be more useful to investigate their co-localization near the DSBs in order to set up an alternative approach that allows quantifying DSBs by the simultaneous detection of two DNA damage markers. Thus, this protocol aims to assess the genomic damage induced in human lymphocytes by the radiomimetic agent bleomycin through the presence of &#947;H2AX and 53BP1 foci in a dual immunofluorescence. Using this methodology, we also delineated the variation in the number of &#947;H2AX and 53BP1 foci over time, as a preliminary attempt to study the repair kinetics of bleomycin-induced DSBs.

This protocol presents a method to assess the formation and repair of DNA double-strand breaks through the simultaneous detection of &#947;H2AX and 53BP1 foci in interphase nuclei of bleomycin-treated human peripheral lymphocytes.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a pseudostratified epithelium lining the lateral ventricles of the embryonic brain. Genotoxic stresses, such as ionizing radiation, have highly deleterious effects on the developing brain related to the high sensitivity of NSPC. Elucidation of the cellular and molecular mechanisms involved depends on the characterization of the DNA damage response of these particular types of cells, which requires an accurate method to determine NSPC progression through the cell cycle in the damaged tissue. Here is shown a method based on successive intraperitoneal injections of EdU and BrdU in pregnant mice and further detection of these two thymidine analogues in coronal sections of the embryonic brain. EdU and BrdU are both incorporated in DNA of replicating cells during S phase and are detected by two different techniques (azide or a specific antibody, respectively), which facilitate their simultaneous detection. EdU and BrdU staining are then determined for each NSPC nucleus in function of its distance from the ventricular margin in a standard region of the dorsal telencephalon. Thus this dual labeling technique allows distinguishing cells that progressed through the cell cycle from those that have activated a cell cycle checkpoint leading to cell cycle arrest in response to DNA damage.
An example of experiment is presented, in which EdU was injected before irradiation and BrdU immediately after and analyzes performed within the 4 hr&#160;following irradiation. This protocol provides an accurate analysis of the acute DNA damage response of NSPC in function of the phase of the cell cycle at which they have been irradiated. This method is easily transposable to many other systems in order to determine the impact of a particular treatment on cell cycle progression in living tissues.

Administration of two analogs of thymidine, EdU and BrdU, in pregnant mice allows the analysis of cell cycle progression in neural and progenitor cells in the embryonic mouse brain. This method is useful to determine the effects of genotoxic stress, including ionizing radiation, during brain development.

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Neurowissenschaften

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Biologie

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Diffuse Optische Spektroskopie zur quantitativen Beurteilung Akute ionisierender Strahlung induzierte Hauttoxizität Mit einem Maus-Modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Medizin

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of treatment, and help guide dose and schedule setting of therapeutics. From a single blood draw, peripheral blood mononuclear cells can be isolated and processed to analyze and quantify protein markers, and plasma samples can be used for the analysis of circulating tumor DNA, cytokines, and plasma metabolomics. Longitudinal samples from a treatment provide information on the evolution of a given protein marker, the mutational status and immunological landscape of the patient. This can only be achieved if the processing of the peripheral blood is carried out effectively in clinical sites and samples are properly preserved from the bedside to bench. Here, we present an optimized general-purpose protocol that can be implemented at clinical sites for obtaining PBMC pellets and plasma samples in multi-center clinical trials, that will enable clinical professionals in hospital laboratories to successfully provide high quality samples, regardless of their level of technical expertise. Alternative protocol variations are also presented that are optimized for more specific downstream analytical methods. We apply this protocol for studying protein biomarkers against DNA damage response (DDR) on X-ray irradiated blood to demonstrate the suitability of the approach in oncology settings where DDR drugs and/or radiotherapy have been practiced as well as in preclinical stages where mechanistic hypothesis testing is required.

This protocol details clinically implementable preparation of high quality PBMC and plasma biosamples at the clinical trial site that can be used for translational biomarker analysis.

Herstellung von peripheren mononukleären Blutzellpellets und Plasma aus einer einzigen Blutentnahme an klinischen Studienstellen für die Biomarkeranalyse

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video