Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. Diese Arbeit wird durch die CRC for Biomedical Imaging Development Ltd finanziert, errichtet und unterstützt unter der australischen Regierung s Cooperative Research Centres (CRC)-Programm. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit.

Zellpräparation <ol><li> Menschliche erythroleukämische K562-Zellen werden in RPMI-1640 Medium mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 20 mg / ml Gentamicin in einem befeuchteten 5% CO 2-Umgebung bei 37 ° C ergänzt gewachsen </li><li> Etwa 18 Stunden vor dem Färben waschen exponentiell wachsenden Zellen (optimal bei 5 x 10 5 Zellen / ml) mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in frischen Medien und zurück auf 37 resuspendieren ° C, 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei etwa 1500 rpm für 5 Minuten und resuspendieren in frisches Medium. </li><li> Zählen von Zellen und stellen Sie die Zelldichte auf ca. 5 x 10 5 Zellen / ml. </li></ol> Die Zellen können entweder durch ein automatisiertes Verfahren (z. B. Sysmex oder Coulter Counter mit Filter der Größe zwischen 5 bis 20 Mikron) oder mit dem Trypanblau-Ausschluss-Verfahren und eine Hämocytometer gezählt werden. Überschüssiges Anzahl der Zellen (&gt; 800 Zellen / cm 2) kann zu ungleichmäßigen Färbung führen. Bestrahlung und Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Montieren Zytospin Clips, Filter-Karten und Folien mit entsprechenden Kennzeichnung. </li></ol> Bei der Montage der Zytospin Gerät sicherzustellen, dass das Loch im Filter-Karte mit dem Trichter fällt. <ol start="2"><li> Expose Zellen entweder γ-Strahlung oder Röntgenstrahlung (2Gy in diesem Beispiel). </li></ol> Um zu verhindern, die Bildung von Schwerpunkten bei der Bestrahlung, um die Zellen auf Eis für 5 bis 10 Minuten vor und während der Bestrahlung. Nach der Bestrahlung inkubiert die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für die erforderliche Zeit (Für Spitzenwerte γH2AX Ebenen 30 Minuten bis 1 Stunde, 1 Stunde in diesem Beispiel). <ol start="3"><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS durch Zentrifugation und Resuspension in frischem PBS. </li><li> Dispense 100 bis 150 ul der Zellsuspension in jedes Zytospin Trichter und drehen sich mit 500 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten. </li><li> Trennen Sie die Folien aus Cytospins und damit die Zellen bis mäßig Luft für ca. 15 Minuten trocknen lassen. </li></ol> Lassen Sie sich nicht Zellen vollständig trocken wie Zellmorphologie kann zerfallen. <ol start="6"><li> Zeichne einen Kreis um die Zellen mit einem hydrophoben Stift. </li><li> Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> In unserer Erfahrung ist Fixierung mit Paraformaldehyd überlegen Fixierung mit Ethanol oder Methanol. Suspensionszellen erfordern Fixierung für 5 Minuten bei RT während längere Fixierung Zeiten (15 bis 20 Minuten) für eine optimale Fixierung der adhärenten Zellen benötigt werden. Wir finden, dass Färbung sofort bessere Ergebnisse als das Speichern der festen Objektträger bei -20 ° C in der Regel ergibt sich eine hohe Hintergrundfluoreszenz. <ol start="8"><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Permeabilisieren die Zellen mit 0,1% Triton-X 100 bei RT für 5 Minuten. </li></ol> Im Vergleich zu Tween-80 haben wir in der Regel zu beobachten bessere Signale in Zellen mit Triton-X 100 permeabilisiert. Je nach Zelltyp kann es erforderlich sein, um die Permeabilisierung der Zeit ändern. Zum Beispiel in K562-Zellen Permeabilisierung für 5 Minuten bei RT ist ausreichend, während in adhärenten Zellen eine 15-minütige Permeabilisierung ist nicht erforderlich. <ol start="10"><li> Wash Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Block-Zellen in 1% BSA für 30 Minuten (3 x 10 Minuten) bei RT. </li></ol> Wir verglichen die Sperrwirkung mit Serum (abgeleitet von derselben Art wie der Sekundärantikörper) und Rinderserumalbumin in PBS. BSA wurde effizienter zu minimieren unspezifische Bindung der sekundären Antikörper im Vergleich zu Serum. Wir verglichen verschiedene Sperrzeiten, über Nacht blockiert bei 4 ° C bis 3 gegenüber x 10 Minuten und 3 x 20 Minuten blockiert Schritte bei Raumtemperatur und bestimmt, dass die Blockierung für 3 x 10 Minuten optimal. <ol start="12"><li> Dann werden 50 ul der primäre Antikörper (1: 500 in 1% BSA verdünnt) zu jedem Dia. </li></ol> Inkubation mit primärem Antikörper bei RT für 60 Minuten führt zu einer verringerten Hintergrundfärbung zu einer Inkubation über Nacht bei 4 ° C im Vergleich <ol start="13"><li> Um Flecken verschiedene Marker gleichzeitig nutzen Antikörper in verschiedenen Spezies (zB Maus-Anti-γH2AX und Kaninchen-Anti-methylierte H3K4 in diesem Beispiel) angehoben. </li><li> Inkubieren mit primären Antikörpern für 90 Minuten bei RT auf einem Schaukelstuhl Plattform mit 250 UpM. </li></ol> Alle Inkubationen werden in einem befeuchteten Färbetrog durchgeführt. <ol start="15"><li> Wash Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Add 50 ul (1: 1000 in 1% BSA verdünnt) sekundäre Antikörper zu jeder Folie. </li></ol> Um Flecken für verschiedene Markierungen auf der gleichen Folie verwenden Sekundärantikörper mit dUNTERSCHIEDLICHE Speziesspezifität (nach dem primären Antikörper) und Fluoreszenz-Emissionswellenlänge (z. B. Anti-Maus-Alexa 488 (grün) und Anti-Kaninchen Alexa-546 (rot) in diesem Beispiel). <ol start="17"><li> Inkubieren Zellen für 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler bei 250 rpm Plattform. </li></ol> Es wird empfohlen, um Zellen in einem dunklen feuchten Kammer zu vermeiden, Ausbleichen und Austrocknen der sekundären Antikörper inkubiert. <ol start="18"><li> Wash Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Add 50 ul (1:500 verdünnt in PBS) TOPRO-3 zu jeder Folie. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit PBS 3x 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit aus Dias und fügen Anti-Fade-Lösung. </li></ol> Es wird empfohlen, nicht auf Zellen vollständig, bevor Sie Anti-Fade-Lösung trocknen. <ol start="22"><li> Deckglas, Dichtung mit Nagellack und lassen Sie gleitet über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li></ol> Es wird empfohlen, konfokale spezifischen Deckgläser # 1.5 (0,16-19 Mikrometer dick) und klaren Nagellack verwenden. Beim Einsetzen der Deckglas auf dem Objektträger, sollte darauf geachtet werden, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Bildaufnahme <ol><li> Ein Zeiss LSM510 Meta Konfokalmikroskop wird verwendet, um Bilder mit dem Standard-GFP (grün, 488 nm), PI (rot 543 nm) und weit rot (blau 633 nm) Laser erwerben. </li></ol> Bilder aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop offenbaren bessere räumliche Auflösung. Da die Größe der γH2AX Brennpunkten kann niedriger sein als 0,5 μicrons, empfiehlt es sich, Bilder mit mindestens einer 0,5 μicron Schrittweite entlang der Z-Achse zu erwerben. Ein 63 x Ölimmersionsobjektiv Objektiv ist im Vergleich zu entweder höher oder niedriger Vergrößerung bevorzugt. Für die Bildgebung viele Zellen für Brennpunkte Zählen ist es besser, eine Scan-Geschwindigkeit von 8 und Bildgröße von 1024 x 1024 Pixel verwenden. Zur Veranschaulichung der räumlichen Beziehung zwischen den verschiedenen nukleären Proteine ​​empfiehlt es sich, eine Scan-Geschwindigkeit von 6 mit Bildgröße von 2048 x 2048 Pixel verwendet wird. Bei der Abbildung von mehreren Kanälen einer Zeilenkamera Akquisition ist im Vergleich zu einem Frame-Scan empfohlen. Dadurch wird vermieden, Bleichen und eine bessere Auflösung erreicht wird. Sequential Scan wird verwendet, um das Durchschlagen zwischen den Kanälen zu verhindern. Foci Zählen Bildanalyse und Schwerpunkte Zählen kann mit verschiedenen Software-Paketen (inlcuding Metamorph, Image-J und Imaris) werden. Das Verfahren für die Herden zu zählen mit Metamorph ist hier beschrieben. <ol><li> Öffnen γH2AX Bildstapeln entweder direkt aus dem Datei-Menü oder indem Sie die Build-Nummer Stacks Option. </li><li> Gehen Sie zum Menü-Prozess und wählte Stack Arithmetik. </li><li> Wählen Sie Maximale Projektion und wählen Sie die Ebenen einbezogen werden und klicken Sie auf OK. </li><li> Speichern Sie die resultierende Bild als γH2AX Tiff. Datei und öffnen Sie die TOPRO-3 (blau) Bild. </li><li> Zum Regionen und wählen Sie eine Region Zeichnung und zeichnen Regionen rund um Kernen. </li><li> Klicken Sie auf γH2AX Tiff Bild und gehen Sie auf Prozess-Menü und wählen morphologische Filter. </li><li> Wählen Sie Top-Hat und wählen γH2AX Bild als Quelle Bild. </li><li> Bewerben Top-Hat-Filter und die daraus resultierende Bild wird ein binäres Bild mit weniger Rauschen und weniger Variation in Herden Intensität. </li></ol> Es sollte darauf geachtet bei der Auswahl Top-Hat-Werte sein. Optimale Werte können durch visuellen Vergleich der Bilder vor und nach der Anwendung von Filtern erzielt werden. <ol start="9"><li> Zum Prozess-Menü und wählen Schwelle Bild. </li><li> Wählen inclusive Schwelle, und wählen Sie den niedrigeren und höheren Schwellenwerten. </li></ol> Es ist in der Regel die Schwellenwerte, die Brennpunkte Zahl beeinflussen. Daher ist viel Aufmerksamkeit erforderlich, wenn Sie Schwellenwerte. Dies kann am besten durch das Zählen Brennpunkte Nummer mit unterschiedlichen Schwellenwerten in Zellen, die weniger als 2 Gy γ-Strahlung erreicht werden und dann vergleichen Brennpunkte Zahlen mit manuellen Zählung (nach Augenmaß). Der optimale Schwellenwert ist derjenige, der die Einbeziehung der Hintergrund minimiert und maximiert die Einbeziehung der Brennpunkte. <ol start="11"><li> Wählen Sie die TOPRO-3 Bild und gehen Sie zu den Regionen Menü und wählen Sie den Transfer Regionen Option. Wählen Sie das Quellbild als TOPRPO-3 und das Ziel als Top-Hat und klicken Sie auf OK. </li><li> Sobald die nukleare Regionen sind die Top-Hat Bild übertragen gehen Sie zu der Maßnahme Menü und wählen Sie Integrierte Morphometrie Analysis. </li><li> In dem Popup-Fenster wählen Sie Quellbild-Top-Hat und messen durch die Gegend. </li><li> Wählen Sie messen alle Regionen und klicken Sie auf Maßnahme, um die Brennpunkte Zahl in allen entsprechenden Kerne in den Top-Hat Bild zu erhalten. </li><li> Die Schwerpunkte Zahlen aus jeder Region in eine MS-Excel-Datei mit der Log-Daten-Option exportiert werden. </li></ol> 3DRekonstruktion von Bildern So erstellen Sie ein 3D-Bild von einem Stapel mit Metamorph: <ol><li> Gehen Sie auf die Stack-Menü und wählen Sie 3D-Rekonstruktion. </li><li> Wählen Sie den Drehwinkel (zB 160 °, 320 °). </li><li> Wählen Sie die 3D-Rekonstruktion Typ-Maximum. </li><li> Wählen Sie die Ebene der Drehung (horizontal oder vertikal). </li><li> Wählen Sie die Z-Kalibrierung zu erreichen. </li></ol> Es ist besser, den Benutzer angegebenen Z-Abstand verwenden (optimal ist 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Wählen Sie OK, um eine 3D-Rekonstruktion zu schaffen. </li></ol> Line-Scan-Analyse Für Line-Scan-Analyse mit Metamorph: <ol><li> Öffnen Sie entweder eine einzelne Ebene Bild oder ein gestapeltes Datei. </li><li> Zum messen Symbolleisten Befehl und wählen Sie Line-Scan-Analyse. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie quer über die Zelle und diese wird automatisch zeigen die Fluoreszenz-Intensität und Entfernung der einzelnen Marker auf dem Weg der Linie. </li></ol> Zur Aufklärung der räumlichen Beziehung von verschiedenen Chromatin Marker, zum Beispiel γH2AX Brennpunkte und Histon-Methylierung, ist es vorzuziehen, Linien, die Regionen, die sowohl dicht und arm in dieser Marker sind span ziehen. Repräsentative Daten Für den Zweck dieser Demonstration verwendeten wir Antikörper gegen γH2AX Brennpunkte und H3K4me, um die räumliche Verteilung der DSBs eines epigenetischen Determinante aktiv Transkription Euchromatin zu bewerten. Wie in Abbildung 1 dargestellt, nach Bestrahlung mit 2Gy, gebildet γH2AX Schwerpunkte vor allem in Regionen, die langweilig für beide H3K4me Färbung und für die DNA-Färbung TOPRO-3 (hell gefärbten DNA-Regionen sind bezeichnend für Heterochromatin) wurden. <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. ΓH2AX Schwerpunkte bilden überwiegend in Euchromatin in Reaktion auf ionisierende Strahlung. (A) Immunfluoreszenz Visualisierung von γH2AX Brennpunkte (grün) in der menschlichen erythroleukämische K562-Zellen, 1 Stunde nach γ-Bestrahlung (2 Gy). γH2AX Schwerpunkte sind in Bezug auf H3K4me gezeigt, was aktive Transkription Euchromatin (rot). DNA wird mit TOPRO-3 (blau) gekennzeichnet. Das fusionierte Bild (blau, rot und grün) zeigt den Ausschluss γH2AX Foci aus heterochromatischen Regionen. Das Line-Scan-Analyse (Fluoreszenz-Intensität vs Distanz) zeigt die relative Verteilung der Marker in einer einzigen Ebene. (B) Scheiben in verschiedenen Ebenen von der 3D-Rekonstruktion des fusionierten Bild oben beschrieben.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Eine frühe molekulare Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) ist die Phosphorylierung des Ser-139-Rest innerhalb der Terminal SQEY Motiv des Histon H2AX 1,2. Diese Phosphorylierung von H2AX wird durch die Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PI3K)-Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3-bezogene (ATR) 3 vermittelt. Die phosphorylierte Form von H2AX, die so genannte γH2AX, breitet sich auf benachbarte Regionen des Chromatins von der Website des DSB bilden diskrete Herde, die leicht visualisiert immunofluorecence Mikroskopie 3 sind. Analyse und Quantifizierung von γH2AX Herden wurde in großem Umfang verwendet werden, um DSB Bildung und Reparatur, insbesondere als Reaktion auf ionisierende Strahlung und zur Bewertung der Wirksamkeit verschiedener Strahlung modifizierende Verbindungen und zytotoxischen Verbindungen 4 bewerten. Angesichts der exquisiten Spezifität und Sensitivität dieser de novo Marker DSBs, hat sie neue Einblicke in die Prozesse der DNA-Schädigung und Reparatur im Rahmen von Chromatin zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel in der Strahlenbiologie das zentrale Paradigma ist, dass die Kern-DNA der kritischen Ziel in Bezug auf die Strahlenempfindlichkeit ist. In der Tat hat der allgemeine Konsens im Bereich weitgehend an das Chromatin als eine homogene Vorlage für DNA-Schäden und Reparatur zu sehen. Allerdings hat mit dem Einsatz von γH2AX als molekulare Marker für DSBs, eine Ungleichheit in γ-Bestrahlung induzierten γH2AX Foci-Bildung in Euchromatin und Heterochromatin beobachtet worden 5-7. Kürzlich haben wir eine Gruppe von Antikörpern, entweder mono-, di-oder tri-methyliert Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), die epigenetischen Prägungen der konstitutiven Heterochromatin und transkriptionellen Silencing und Lysin 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 sind ), die eng korreliert aktiv Transkription euchromatischen Regionen, um die räumliche Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung 8 zu untersuchen. In Übereinstimmung mit der herrschenden Vorstellungen über Chromatin Biologie, angegeben unsere Ergebnisse eine enge Korrelation zwischen γH2AX Bildung und aktive Transkription 9. Hier zeigen wir unsere Immunfluoreszenz Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in nicht-haftenden Zellen mit einem besonderen Fokus auf Co-Lokalisation mit anderen epigenetischen Markierungen, Bildanalyse und 3D-Modellierung.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K Aufrufe.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Serie: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Forschung

Biologie

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analyse von SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Dosimetrie für Zellbestrahlung mit Orthovoltage (40-300 kV) Röntgenanlagen

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...