Unser Protokoll bietet ein biotechnologisches 3D-Modell, das das native Gewebe stark beeinflusst. Dies kann möglicherweise genutzt werden, um neue Therapeutika und Biomarker für die Behandlung und Diagnose von Neuroblastomen zu entdecken. Der Hauptvorteil besteht darin, dass physiologisch relevantere experimentelle Bedingungen geschaffen werden, um die Mikroumgebung des Tumors mit einer reproduzierbaren Technik zu untersuchen, die eine Konsistenz von Charge zu Charge erreicht.
Unsere Gerüstmethode kann zum einen zur Identifizierung neuartiger Therapeutika für Neuroblastome und zum anderen zur Einbeziehung von Patientenzellen zur besseren Vorhersage des individuellen Ansprechens des Patienten eingesetzt werden. Legen Sie zunächst das in PBS gelagerte Gerüst in die Laminar-Flow-Haube. Verwende eine sterile Pinzette, um das Gerüst vorsichtig aus der Ecke zu heben, und drücke gegen die Seitenwand, um überschüssiges PBS zu entfernen.
Platzieren Sie dann das Gerüst mit der glänzenden Schicht nach unten in der Mitte der Vertiefung einer nicht haftenden 24-Well-Platte. Beschriften Sie die Platte mit Details zur Zelllinie, zur Aussaatdichte und zu den Zeitpunkten. Arbeiten Sie mit den Zellen mit jeweils einer Aussaatdichte und bewahren Sie die restlichen Zellen bei 37 Grad Celsius im Inkubator auf, bis sie gebrauchsfertig sind.
Verwenden Sie für die Zellbefestigung im Gerüst eine P20-Pipette mit sterilen Spitzen, um die Zellsuspension gründlich zu mischen, und fügen Sie 20 Mikroliter der entsprechenden Zellsuspension in die Mitte jedes Gerüsts hinzu, wobei Sie sicherstellen müssen, dass die Zellsuspension auf dem Gerüst und nicht auf der Seitenwand oder dem Boden der Vertiefung verbleibt. Lassen Sie die Zellen drei bis fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit haften. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine P1000-Pipette, um langsam einen Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium in jede Vertiefung zu geben, um eine Verschiebung der Gerüste zu verhindern, und inkubieren Sie die Platte über Nacht.
Beobachten Sie die Gerüste zunächst alle zwei bis drei Tage auf Farbveränderungen des Wachstumsmediums, während sich die Zellen innerhalb des Gerüsts vermehren. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipettenpistole im Slow-Modus, um einen Milliliter des verbrauchten Mediums aus der Vertiefung zu entfernen und zu entsorgen. Wenn das konditionierte Medium für das Experiment verwendet wird, sammelt man das verbrauchte Medium der biologischen Replikate in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pelletiert die Zelltrümmer durch Zentrifugation.
Füllen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen um und lagern Sie das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie die Pipettenpistole auf den Tropfmodus gestellt haben, geben Sie vorsichtig zwei Milliliter vorgewärmtes Wachstumsmedium in die Gerüste. Bebrüten Sie die Gerüstplatte und füllen Sie das frische Medium für die Dauer der gewünschten Wachstumsperiode auf, wie gezeigt.
In der Laminar-Flow-Haube wird das entsprechende Reagenz des Zellviabilitäts-Assays durch Filtration durch einen 0,2-Mikrometer-Sterilfilter in ein Zentrifugenröhrchen sterilisiert. Die sterile Lösung, das vollständige Wachstumsmedium und das sterile PBS im Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Übertragen Sie die zu analysierenden Scaffolds mit einer sterilen Pinzette in eine frische 24-Well-Platte und beschriften Sie die Platte mit allen relevanten Details.
Geben Sie 900 Mikroliter des vorgewärmten Wachstumsmediums in jede Vertiefung. Geben Sie dann 100 Mikroliter des sterilen Zellviabilitätsreagenzes in jede Vertiefung. Für eine Negativkontrolle werden 900 Mikroliter Medium und 100 Mikroliter des sterilen Zellviabilitätsreagenzes in eine Vertiefung ohne Gerüst gegeben.
Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte und wiegen Sie die Platte etwa drei Minuten lang vorsichtig, um das verdünnte Reagenz der Zellviabilität im gesamten Well zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator genommen haben, wiegen Sie die Platte einige Sekunden lang vorsichtig und erzeugen Sie die Triplikate, wie im Textmanuskript gezeigt.
Erzeugen Sie die technischen Triplikate, indem Sie 100 Mikroliter des inkubierten Mediums und Reagenzes aus einer Vertiefung der 24-Well-Platte in eine Vertiefung der transluzenten 96-Well-Platte überführen, und führen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal für eine Vertiefung durch. Decken Sie die 96-Well-Platte mit Aluminiumfolie ab, um das Zellviabilitätsreagenz vor Licht zu schützen. Entfernen und entsorgen Sie die restlichen 700 Mikroliter Medium und Reagenz von den Gerüsten in der 24-Well-Platte.
Waschen Sie jedes Gerüst zweimal mit einem Milliliter sterilem PBS. Verwenden Sie ein Mikroplatten-Lesegerät, um die Absorption bei 570 und 600 Nanometern zu messen, und berechnen Sie die prozentuale Reduzierung der Zellviabilitätsreagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Statistische Analyse der Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit mit geeigneter Software.
Geben Sie die biologischen Dreifachwerte ein, um Fehlerbalken zu erstellen und die Assay-Variabilität anzugeben. Führen Sie eine einseitige Varianzanalyse durch, um die Veränderungen der Zelllebensfähigkeit über den experimentellen Zeitraum mit geeigneter biostatistischer Software zu untersuchen. Geben Sie signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten in den Diagrammen an, wie im Textmanuskript beschrieben.
Die Lebensfähigkeit von zwei Neuroblastom-Zelllinien, KellyLuc und IMR32, die auf den Scaffolds gezüchtet wurden, wurde untersucht. Die erhöhte Zelldichte führte mit der Zeit zu einer stärkeren Verringerung des Zellviabilitätsreagenzes. Das Zellwachstum auf den Gerüsten wurde indirekt durch Quantifizierung der aus den Gerüsten extrahierten DNA gemessen und die Zellen pro Probe berechnet.
Die IMR32-Zellen zeigten mit der Zeit ein verstärktes Wachstum, dann die KellyLuc-Zellen. Die Wachstumsmorphologie und die Verteilung der Zellen auf den Gerüsten wurden visuell durch Hämatoxylin-, Eosin- und immunhistochemische Färbung beurteilt. KellyCis83-Zellen wuchsen schneller und infiltrierten tiefer in beide Gerüstzusammensetzungen als die weniger invasive Kelly-Zelllinie.
IMR32, das auf Nano-Hydroxylapatit gezüchtet wurde, zeigte über einen Zeitraum von 14 Tagen ein kontrastreiches Wachstumsmuster mit großen, dicht gepackten Clustern. Die zellspezifischen Merkmale wurden durch immunhistochemische Färbung überwacht, gefolgt von Phalloidin- und DAPI-Färbung, und die Häufigkeit von Aktin wurde in Kelly- und KellyCis83-Zellen auf Kollagen-Glykosaminoglykan-Gerüsten beobachtet. Für die in vitro zelluläre Aktivitätsbewertung wurden die sezernierten Konzentrationen von Chromogranin A gemessen, und die Zellen, die auf Kollagen-Glykosaminoglykan- und Kollagen-Nano-Hydroxylapatit-Gerüsten gezüchtet wurden, produzierten mehr Chromogranin A als das Wachstum auf konventioneller 2D-Kultur.
Die chemoresistente KellyCis83-Zelllinie sezernierte mehr Chromogranin A als die Kelly-Zelllinie. Nach der Zelladhäsion können die Zellen mit verschiedenen Therapeutika behandelt werden. Dies würde physiologisch relevantere Ergebnisse für die Reaktion der Zellen auf Medikamente liefern als herkömmliche 2D-Kulturen.
Diese Technik ermöglicht es den Forschern, besser zu untersuchen, wie sich Krebszellen verhalten und auf einen Reiz innerhalb der Tumormikroumgebung reagieren, der von der Reaktion auf Therapeutika bis hin zu Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen reicht.
