Wir danken Dr. Wenjin Chen für ihre Hilfe bei der MATLAB-Programm und dem Cancer Institute of New Jersey Histopathologie Anlage und Mikroskopie-Anlage. Wir danken auch den Gutachtern für ihre Kommentare und Vorschläge. Diese Studie wird von der Raymond und Beverly Sackler Forschungsgemeinschaft unterstützt.

1. Herstellung von 1% Agarose-beschichtete 24-Well Platte <ol><li> 1 g Agarose (RPI, A20090-500) auf 100 ml entionisiertem Wasser in einem 250 bis 500 ml-Flasche und Autoklaven sterilisieren, um die Agarose (121 ° C, 15 bar, 15 min im Autoklaven Maschine). Übertragen Sie die Flasche mit sterilisierten Agarose in ein 70 ° C warmes Wasserbad. Die Agarose ist bereit, gegossen, wenn es um 70 ° C, die etwa eine Stunde dauert gekühlt wird werden. Vergewissern Sie sich, um die Agarose steril zu allen Zeiten zu halten. </li><li> Besorgen Sie sich die 24-Loch-Flachboden-Platten (Falcon, 353047), jede Art der 24-Loch-Flachboden-Platten funktionieren würde, wenn die Platten unter einem Phasenkontrast-Mikroskop abgebildet werden können. </li><li> Geben Sie 200 ul Agarose in jede Vertiefung mit einer Eppendorf-Pipette Repeater in einer biologischen Sicherheitswerkbank und wirbeln die Agarose um den Brunnen zu machen, die auch gleichmäßig bedecken. 200 ul Agarose ist angebracht, eine konkave Oberfläche bilden, so dass die konsequente Sphäroide kugelige Formen bilden können. Weniger als 200 ul Agarose kann nichtdecken die auch ganz, aber mehr als 200 ul Agarose nicht bilden die konkave Oberfläche und die Sphäroide darauf gewachsenen nicht zu sphärischen Formen. </li><li> Die Agarose-beschichtete 24-Well-Platten werden, aber in etwa 10 min verwendet werden. (Optional) Geben Sie 100 ul Medium, um die Agarose mit Kulturmedium vor der Aussaat Zellen ausgleichen. </li><li> Alternativ kann nach der Agarose vollständig erstarrt ist, werden 100 ul Wachstumsmedium in jede Vertiefung und dichten die Platten mit dem sterilen Dichtband (Nunc, 236366). Diese Platten können bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Einzelzell-Suspensionen <ol><li> Alle Experimente werden durchgeführt unter Verwendung der üblichen aseptischen Techniken in einer biologischen Sicherheitswerkbank und alle Kulturen sind in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft gewachsen, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Menschlichen Pankreas-NET BON-1-Zellen werden in DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, gehalten Invitrogen,16000-044) Medium in einem 100 mm x 20 mm steril Gewebekulturschale (Corning, 430.167). </li><li> Wenn Monoschicht BON-1-Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, wird das Medium entfernt. Die Zellen werden mit PBS zweimal gewaschen und vertrieben von der Schale durch Zugabe von 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) mit 5 min Inkubation bei 37 ° C TrypLE ähnelt, aber Trypsin bei 15 stabil - 30 ° C sowie bei 4 ° C Prüfen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, werden alle Zellen von der Schale gelöst werden. </li><li> In 9 ml Wachstumsmedium auf die Zellen trypsiniert und mit einer Pipette, um Zellen und Abpipettieren ein paar Mal, um eine noch einzelne Zellsuspension zu gewährleisten. </li><li> Verwenden 70 um Zellsieb (Fisher, 22.363.548), um die Zellen zu filtern. </li><li> Sammle Zellen und führen Sie eine Zellzahl mit Guava PCA-96 Base System (Millipore). </li><li> Eine Suspension von 5.000 Zellen pro ml in phenol-DMEM/F12 mit 10% FBS Wachstumsmedium. </li></ol> 3. Spheroid Kultur <ol><li> Overlay 200 ul der einzelnenZellsuspensionen auf der Agarose-beschichteten 24-Well-Platte und dichten die 24-Well-Platten mit der sterilen Dichtband um Verdunstung zu verhindern. </li></ol> Hinweis: - Die Anzahl der Zellen zu plattierenden ist empirisch basierend auf der Größe der Kügelchen am Tag 6 bestimmt werden; 300-400 Mikrometer Durchmesser der Kügelchen wäre die ideale Größe für den Start der medikamentösen Behandlung sein, 1000 BON-1 und H727-Zellen werden ausplattiert. - Wir raten ab medikamentöse Behandlungen nach Tag 6, weil die Lebensfähigkeit der Zellen 3D beginnt ab ca. Tag 10 (Daten nicht gezeigt, Manuskript in Vorbereitung) fallen zu lassen. <ol start="2"><li> Platzieren Sie die oben Agarose-beschichtete 24-Well-Platten mit BON-1-Zellen auf einem Schüttler mit einer sehr langsamen Rühren von weniger als 40 Umdrehungen pro Minute über Nacht in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft. Dann bewegen Sie diese Platten auf einer stabilen Plattform zu halten, die Kulturen wachsen. </li><li> Geben Sie 200 ul Wachstumsmedium in jede Vertiefung der Platte obens alle 3 Tage. Bitte nicht stören die Sphäroide. Versuchen Sie, Medium durch die Wand jeder Vertiefung hinzufügen, indem Sie die Pipettenspitze auf der Seite des gut und lassen den Durchfluss des Mediums in den Brunnen hinab. </li><li> Überwachen Sie die Sphäroid-Bildung in den 24-Well-Platten unter dem Mikroskop. </li></ol> 4. Medikamentöse Behandlung <ol><li> Wenn die Sphäroide rund 300-400 um Durchmesser am Tag 6 erreichen, werden die 3D-Sphäroiden mit Medikamenten behandelt. Dies wird als Tag 0 für medikamentöse Behandlung bezeichnet. </li><li> An Tag 6 enthält jede Vertiefung der Platte ca. 400 ul Medium. Um sicherzustellen, dass die medikamentösen Behandlungen sind bei 1x Endkonzentration in jede Vertiefung, 3x serielle Verdünnungen von jeder Gabe von Behandlungen werden von der Droge Lager in 5 ml Wachstumsmedium in einer 15 ml konischen Röhrchen, das ist genug für 8 Wiederholungen gemacht. </li><li> Die Sphäroide in jeder Zeile der 24-Well-Platte werden als Vehikel, Dosis 1, 2, 3, 4 und 5 kategorisiert. Es gibt 4 Wiederholungen für jede Dosis von Behandlungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen (siehe <strong&gt; Tabelle 1). Wir Regel behandeln 3D Sphäroide bei mindestens 2 Platten mit 24 Vertiefungen, wodurch mindestens 8 Wiederholungen für jede Dosis von Behandlungen. </li><li> Drehen Sie den 24-Well-Platte bei 800 rpm für 5 min bei 4 ° C, um sicherzustellen, dass alle Verdichtungen auf der Dichtband in den Brunnen zu gehen. Aufgrund der schwimmenden Merkmal der 3D Sphäroide, wird das Medium in jeder Vertiefung nicht entfernt, um die Störung der Sphäroide zu vermeiden. </li><li> Vorsichtig 200 ul der oben maßgeschneiderte Behandlungen jeder Dosis in die entsprechenden Vertiefungen an der Wand entlang eines jeden gut. </li><li> Versiegeln Sie die 24-Well-Platten mit dem Dichtband und inkubieren Sie die Kulturen in der 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 in Luft. </li><li> Bei Bedarf zurückziehen, die Sphäroide in jede Vertiefung mit der jeweiligen Dosis von Behandlungen nach 72-96 Std. </li></ol> 5. 3D-Monitor Spheroid Kulturen <ol><li> Bei jedem gewählten Zeitpunkt nach Behandlungen (0, 24, 48, 72 h), die Sphäroide in jede Vertiefung ter 24-Well-Platte werden mit einem Zeiss Axiovert 200/M-based Phasenkontrast-Mikroskop mit einem 5fach Objektiv abgebildet. </li></ol> Hinweis: Bilder können auf jedem Lichtmikroskop mit einem kalibrierten Skalierung zwischen um-und Pixel-genommen werden. Ein 5fach Objektiv ist ideal, weil die Sphäroide schnell herauswachsen den Imaging-Bereich mit einem 10-fach Objektiv. <ol start="2"><li> Spheroid Analyse kann manuell durchgeführt werden mit Zeiss AxioVision 4.8.2 Software mit den RAW-Bildern. </li><li> Alternativ wird eine kundenspezifisch entwickelte MATLAB-Programm verwendet werden, um die Größe der Sphäroide automatisch / halbautomatisch zu schätzen. Das Automatik-Programm implementiert die aktive Konturalgorithmus 4 bis genau zu lokalisieren Kontur der Sphäroid in einem gegebenen Bild und messen ihre großen (L) und Minor (W) Achsen automatisch. Eine halbautomatische Version des gleichen Algorithmus erlaubt es Benutzern zu helfen, das Programm zu initiieren, wenn starke Artefakt vorhanden ist. Alle Bilder müssen als TIFF-oder JPEG-Dateiformate aus exportiert werdenDie RAW-Bilder in das Programm eingelesen werden. Das Volumen des Sphäroid ist als 0,5 x L x W 2 geschätzt. </li></ol> 6. HistoGel-Einbettung der 3D-NET Sphäroide <ol><li> 10-24 Sphäroide aus den 24-Well-Platten gesammelt, zweimal in PBS gewaschen, in 10% Formalin für 2 Stunden fixiert, gewaschen mit 50% und 70% Ethanol zweimal für 15 min, jeweils, und sind für HistoGel Einbettung bereit. Alternativ können sie in 70% Ethanol bei 4 ° C werden für mehrere Monate aufbewahrt. </li><li> Eine Röhre von kalten HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) wird in einem Becherglas mit Wasser gefüllt stellen. Das Becherglas wird in einer Mikrowelle für 1 Minute erhitzt, bis das Gel oder vollständig verflüssigt wird, dann in der gleichen Wasser gefüllten Becher zu allen Zeiten gehalten. </li><li> Die Sphäroide in 70% Ethanol von oben in eine Biopsie cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) mit einem Zahnstocher übertragen. Achten Sie darauf, alle Sphäroiden übertragen werden. Lassen Sie die Sphäroide sitzen für eine Minute zu sinken bis auf den Boden der Biopsy cryomold. Versuchen Sie, loszuwerden, die Flüssigkeiten in der Biopsie cryomold mit Kimwipes und inzwischen sehr vorsichtig in das Sphäroide in die Mitte am unteren Rand der Biopsie cryomold mit der Einweg-Kunststoff-Pasteurpipette. Dieser Schritt kann leichter unter einem Präpariermikroskop durchgeführt werden. </li><li> Eine dünne Schicht von erwärmtem HistoGel auf der Biopsie cryomold hinzugefügt, um die Sphäroide am unteren Ende der Biopsie cryomold stabilisieren, das inzwischen Zahnstocher wird verwendet, um die Sphäroide in der Mitte an der Unterseite der Biopsie cryomold sehr sanft zu halten. Sie nicht zu viel HistoGel aber gerade genug zur Stabilisierung der Sphäroide im unteren Bereich der Biopsie cryomold. </li><li> Lassen Sie die Sphäroide / HistoGel sitzen für 1-2 min bei Raumtemperatur oder bis der HistoGel verfestigt wird. Dann füllen Sie den Rest der Biopsie cryomold mit der erwärmten HistoGel. </li><li> Lassen Sie es bei Raumtemperatur für ca. 10 min zu verfestigen. </li><li> Kurz vor dem Herausspringen der Sphäroide / HistoGel Block von der Biopsie cryomold, leave bei 4 ° C für 1 min, was Herausspringen der intakten Sphäroide / HistoGel Block hilft. Die Sphäroide / HistoGel Block wird dann in einem Stück Bio-Wraps (Surgipath, 01090) gewickelt und in ein Gewebe und Biopsie-Kassette (Fisher Scientific, 15 bis 182-701d). Das Gewebe und Biopsie Kassette in einem Behälter mit 70% Ethanol gelagert. Dann geht die Routine Gewebe Verarbeitungsverfahren für Paraffineinbettung befolgt werden. 5 </li><li> Das Paraffin-Block kann im Schnitt in 3-um dicke Schicht Dias. Die Folien können mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt werden, um histologische Veränderungen bestimmen und kann auch für immunhistochemische Färbung verwendet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Die menschliche pankreatische neuroendokrine Tumor-Zelllinien BON-1 (zur Verfügung gestellt, um Verto Institut von Kjell Oberg, Universität Uppsala, Schweden), QGP-1 (japanische Health Sciences Foundation, Osaka, Japan), und die menschliche Lunge neuroendokrinen Tumor-Zelllinie H727 (ATCC) wurden gewachsen auf einem agarosE-beschichtete 24-Well-Platte. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, zeigen die drei Zelllinien unterschiedlicher Morphologie. BON-1 und H727 Zellen gebildet 3D Sphäroide. Unter dem Mikroskop zeigte H727 Zellen dichter und kompakter als Sphäroide BON-1-Zellen. Wir vermuten, dass H727-Zellen eine erhöhte Fähigkeit zur Zell-Zell-Adhäsion haben und bilden engere Verbindungen als Ergebnis. QGP-1-Zellen zeigen eine große Trauben, poröse Massen, die nicht als Kugeln betrachtet werden. Aufgrund der steigenden Interesse neuroendokriner Tumor Forschung in den letzten Jahren sind BON-1-Zellen für den Rest der Figuren verwendet. Nach dem Impfen BON-1-Zellen auf die Agarose-beschichteten 24-Well-Platte, mehrzellige Sphäroide Bildung erfolgt typischerweise durch die 3. oder 4. Tag und die Sphäroide runder geworden durch die 6. Tag. Aufgrund der Nährstoffe und Sauerstoff Einschränkung Zellen in der dichten Kern der Sphäroide um Tag 10 und am Tag 17 sterben zu starten, beginnt die Sphäroide auf Grund der Größe oder zerfallen, somich Fällen den Auswurf des nekrotischen Kern. Die Sphäroide in der Regel können bis zu 1.000 m im Durchmesser. Abbildung 2 zeigt die Bereiche der Bildung, Wachstum und Zerfall von BON-1 3D Sphäroide. Drug Behandlungen wurden gestartet, wenn Sphäroide waren rund 300 bis 400 mu m und Zellen zurückgehalten hohe Rentabilität (Manuskript in Vorbereitung). Tag 6 3D Sphäroide wurden als Startpunkt für medikamentöse Behandlungen gewählt. Es wurde berichtet, dass Histondeacetylaseinhibitoren antiproliferativen und proapoptotischen Effekte auf die NET-Zellen zeigten. 6 Wir haben uns für die Histon-Deacetylase-Inhibitor-Trichostatin A (TSA) als ein Beispiel, um die Wirkung der medikamentösen Therapie auf 3D-NET Sphäroide zu illustrieren. 3A zeigt die Morphologie der 3D Sphäroide auf die Behandlung von TSA. 3B zeigt das Volumen der 3D Sphäroide nach TSA (Sigma, T8552) Behandlung. Die Größe der einzelnen Sphäroids wurde automatisch von einem Kunden geschätztMATLAB Computerprogramm tom entwickelt. 4 A Handzeichnung Schritt zugegeben, um bei dem Erwerb der Sphäroide, die nahe an den Rand in einem gegebenen Bild waren. Mindestens 8 Sphäroide wurden pro Dosis der TSA-Behandlungen zu jedem Zeitpunkt gemessen. Das Volumen jeder 3D-Sphäroid wurde als 0,5 x Länge x Breite 2 berechnet. Wie in 3A und 3B, im Verhältnis zum Fahrzeug gesehen, zeigten alle Dosen von TSA in den Figuren gezeigt, einen gewissen Grad der Wachstumshemmung von BON-1 3D Sphäroide. Unter diesen sind die Konzentrationen von 125 nM und 250 nM TSA stark unterdrückt das Wachstum von 3D Sphäroide und führte zu Zelltod bei 96-Stunden-Zeitpunkt. Um die Histologie der NET 3D Sphäroide zu verstehen, ein H &amp; E und immunhistochemischen (IHC) Färbung wurden auf 3D Sphäroide, die für 17 Tage kultiviert worden waren durchgeführt. 4A veranschaulicht ein Verfahren zur 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung zu verarbeiten, das ist der Schlüssel Schritt für Paraffin-Einbettung von 3D Kugelgraphit<html> OIDs. 4B zeigt die H &amp; E-Färbung, die immunhistochemische Färbung der Caspase-3 (ein Marker für apoptotische Zellen) und Ki-67 (ein Marker für proliferierende Zellen) Antikörper auf 3D Sphäroide, die für 17 Tage gezüchtet worden waren, . Die Zellen innerhalb des Kerns der 3D Sphäroide sind meist nekrotischen / apoptotischen und die äußere Schicht Zellen aktiv vermehren. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Die Morphologie des NET 3D Sphäroide. Die 3D Sphäroide aus drei humanen neuroendokrinen Tumor-Zelllinien werden auf Agarose-beschichtete 24-Well-Platten ausgebildet sind. 1000 BON-1, H727 und QGP-1-Zellen wurden auf Agarose-beschichtete 24-Well-Platten angeimpft und in einem normalen physiologischen Zustand, wie in dem Protokoll. Dies sind die Bilder von 3D Sphäroide für BON-1 und H727 oder Zellaggregate für QGP-1, die für 10 Tage kultiviert wurden. 18/4218fig2.jpg &quot;alt =&quot; Bild 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Der Growth-Tracking von BON-1 3D Sphäroide Das Wachstum Verfolgung von BON-1 3D Sphäroiden:. Bildung, Wachstum und Zerfall von 3D-Sphäroiden. Wie im Protokoll detailliert, werden 1.000 BON-1-Zellen auf ein Agarose-beschichtete 24-Well-Platte ausplattiert. Die Zellen in einem Standard-DMEM/F12-Medium sind mit 10% FBS auf einem Schüttler in einem physiologischen Zustand über Nacht gewachsen, zog dann auf einer stabilen Plattform gewachsen und im gleichen Zustand. Das Wachstum der 3D-Tracking-Zellen wurden durch bildgebende Zellen jede Stunde für die ersten 5 Stunden nach dem Ausstreichen gefolgt, und dann alle 1-3 Tage mit einem Zeiss Axiovert 200/M-based Phasenkontrast-Mikroskop mit einem 5fach Objektiv. Die Zellen lagern sich zu Massen zuerst, dann bilden mehrzellige Aggregate, kleine Kügelchen, Sphäroiden größer, und schließlich die Sphäroide zerfallen. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. TSA-Behandlung auf BON-13D Sphäroide. (A) Bilder von 3D-Sphäroiden auf TSA-Behandlung. Behandlungsgruppe: V - Fahrzeug (0,0025% DMSO); D1-Dosis von 1 (15,625 nM TSA); D2-Dosis 2 (31,25 nM TSA); D3: Dosis 3 (62,5 nM TSA); D4: Dosis 4 (125 nM TSA ); D5: Dosis 5 (250 nM TSA). Zeitpunkt der Behandlung: 0 H - Zeit Punkt, dass Behandlungen am Tag 6 3D Sphäroide gestartet, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h sind die Zeitpunkte, nachdem die Behandlung begonnen. 3D Sphäroide wurden zu jedem Zeitpunkt als bisher dargestellt. (B) Das Wachstum der 3D-Sphäroiden auf TSA-Behandlung. Die großen (L) und kleinere (W) Achsen der 3D Sphäroiden in (A) wurden automatisch durch Matlab Programm zu jedem Zeitpunkt der Behandlung (0, 24, 48, 72 und 96 Stunden) geschätzt. Das Volumen der 3D Sphäroide wurde als 0,5 x L x W 2 geschätzt. Das Volumen des Sphäroids im Diagramm war der Durchschnitt von 8 Replikaten und die Fehlerbalken wurde auf der Basis 8 Replikaten berechnet. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> Tabelle 1.Anordnung der medikamentösen Behandlungen auf einer 24-Well-Platte <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="4A" /> 4A. Darstellung eines Verfahrens zur 3D Sphäroide für HistoGel Verankerungsprozess. Ein Verfahren zur 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung und immunhistochemische Färbung der 3D-Sphäroiden (A) Ein Überblick über eine Methode, um 3D-Sphäroiden für HistoGel Einbettung zu verarbeiten. 3D Sphäroide wurden in einem HistoGel eingekapselt werden, um auf dem gleichen Niveau in der Biopsie cryomold, dann wird die HistoGel / Sphäroide Block wurde in einem blauen Bio-Packungen verpackt und in einen gelben Biopsie Kassette für Paraffineinbettung sein. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="4B" /> 4B. H &amp; E Färbung und immunhistochemischen Färbung von Tag-17 3D Sphäroide. (B) H &amp; E Färbung, Immunhistochemische Färbung von Ki-67 und Caspase-3 der 17-tägigen 3D Sphäroide. Die paraffin-embedded geschnittene Folien waren entparaffinierten und Antigen-Retrieval wurde mit CCI (Cell Conditioning Solution, Verana Medical System, # 711-065-152). Polyklonaler Kaninchen-Antikörper Ki-67 (# Abcam. Ab833) und Caspase 3-Antikörper (Cell Signaling Technology, # 9661) wurden bei einer Konzentration von 1:75 und 1:200 angelegt werden, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson Immunolab, # 711-065-152) wurde bei 1:500 für 1 Stunde bei Raumtemperatur aufgebracht, gefolgt von chromogenen Nachweis-Kit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und dehydrierte und gelöscht werden, bevor Eindecken aus Xylol.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Verfahren zum Bilden 3D mehrzelligen Sphäroids von humanen neuroendokrinen Tumorzellen unter Verwendung von Agarose-beschichteten 24-Well-Platten gezeigt. Der Erfolg dieser Technik ist die Möglichkeit, eine einzelne Sphäroids mit homogener Größe und einheitliche Form am Tag 6 ausgehend von einer festen Anzahl von Zellen zu erhalten. Der entscheidende Schritt ist die langsame Bewegung der Platte mit NET-Zellen zum ersten 16-24 h nach der Beschichtung. Dieses Verfahren kann auch zur Anwendung gemeinsamen menschlichen Brustkrebszellen MCF-7, menschlichen Kolon-Adenokarzinomzelllinie HT-29, humanen, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom-Zelllinie H1299 und humane embryonale Nieren-Zelllinie HEK-293. Sie können alle bilden eine einheitliche und kompakte 3D Sphäroide für therapeutisches Drug-Bildschirm (Daten nicht gezeigt). Obwohl mehrere Verfahren zum Generieren 3D Sphäroide gemeldet, gemeldet 7-10 hier das Verfahren erfordert keine spezielle Platten oder Reagenzien und ist somit einfach und kostengünstig. Unsere unveröffentlichte Daten demonstrate, dass NET 3D Sphäroide auf Agarose gewachsen imitieren die In-vivo-NET Xenograft Tumor geometrisch und molekular, wenn auf 2D-Monolayer-Zellen verglichen. Dies ist ähnlich dem, was für die 3D-Sphäroide aus der anderen menschlichen Krebszelllinien aus berichtet. 11,12 Die Begrenzung des 3D-Modell Zellkultur ist, dass sie nicht vollständig ersetzen Testung der In-vivo-Wirksamkeit von Drogen oder therapeutische Behandlungen, da die 3D-Sphäroide sind wie avaskulären Tumoren, die sich von der in vivo Tumor in diesem Aspekt. Dennoch wird diese Methode zur Lücke und Einschätzungen NET therapeutische Medikamente aus in vitro, in vivo in einigen Aspekten. Immunfluoreszenzfärbung auf vielzelligen Sphäroide ist sehr schwierig durchzuführen aufgrund der Größe und Geometrie der schwebenden 3D Sphäroide und die Begrenzung des konfokalen Mikroskops. Hier zeigen ein Verfahren zur Einbettung HistoGel für Paraffin verarbeitenEinbettung und ermöglicht immunhistochemische Färbung der seriellen Schnitt gleitet der 3D-Sphäroiden. Außerdem hilft unseren Kunden entwickelte MATLAB-Programm genau und reproduzierbar schätzen den Umfang der Sphäroide, überwachen die Wirksamkeit von Medikamenten effizient und könnte sich zu einem Hochdurchsatz-Screening in der Entwicklung von Medikamenten für Patienten NET integriert werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Medien </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td> Gibco </td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> Falke </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mM Zellsieb </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Dichtband </td><td> Nunc </td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td> Trichostatin A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> Orbitalschüttler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy

Neuroendokrinen Tumoren (NET) sind seltene Tumoren mit einer Inzidenz von zwei je 100, 000 Personen pro Jahr, auf sie entfallen 0,5% aller menschlichen Tumoren. 1 Andere als die Chirurgie für die Minderheit der Patienten, die mit lokalisierter Erkrankung stellen, gibt es wenig oder gar keinen Überlebensvorteil der systemischen Therapie. Deshalb gibt es ein großes Bedürfnis zum besseren Verständnis der Biologie der Netze und insbesondere die Festlegung neuer therapeutischer Ziele für Patienten mit nicht resektablen oder metastasierten neuroendokrinen Tumoren. 3D-Zellkultur ist immer eine beliebte Methode für Wirkstoff-Screening aufgrund ihrer Relevanz in der Modellierung der in vivo Tumorgewebe Organisation und Mikroumgebung. 2,3 Die 3D mehrzelligen Sphäroiden könnte wertvolle Informationen in kürzerer Zeit und kostengünstiger Art und Weise bereitzustellen, als direkt ausgehend von 2D- Zellkultur-Experimenten an Tieren (Mäuse-) Modelle. Um die Entdeckung neuer Therapeutika für NET-A-Erleichterungients, haben wir ein in vitro 3D mehrzelligen Sphäroiden Modell unter Verwendung der menschlichen NET-Zelllinien entwickelt. Die NET-Zellen werden in einem nicht klebenden Agarose-beschichtete 24-Well-Platte ausplattiert und unter physiologischen Bedingungen (5% CO 2, 37 ° C) mit einer sehr langsamen Rühren für 16-24 Stunden nach dem Ausstreichen. Die Zellen bilden mehrzellige Sphäroide ab dem 3. oder 4. Tag. Die Sphäroide werden mehr kugelförmig von der 6. Tag, an welchem ​​Punkt die medikamentöse Behandlung eingeleitet werden. Die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen auf den Sphäroiden NET basiert auf der Morphologie, Form und Größe der Sphäroide mit einem Phasenkontrast-Lichtmikroskop beobachtet. Die Größe der Kügelchen wird automatisch mit Hilfe eines speziell entwickelten MATLAB-Programm auf einer aktiven Kontur-Algorithmus geschätzt. Darüber hinaus demonstrieren wir eine einfache Methode, um die Einbettung HistoGel auf diesen 3D Sphäroide zu verarbeiten, was die Verwendung von Standard-histologische und immunhistochemische Techniken. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Dies ist der erste Bericht über die Erzeugung von 3D-Sphäroiden mit NET-Zelllinien, die Wirkung von Medikamenten zu untersuchen. Wir haben auch auf diesen 3D-Histologie Sphäroide durchgeführt und angezeigt ein Beispiel für ein einziges Medikament die Wirkung auf das Wachstum und die Proliferation der NET-Sphäroiden. Unsere Ergebnisse unterstützen, dass die NET-Sphäroiden wertvoll sind für weitere Studien von NET Biologie und Entwicklung von Medikamenten.

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Wir präsentieren eine einfache Agarose-Overlay-Plattform, um 3D-mehrzellige Sphäroide mit neuroendokrinen Krebszellen wachsen. Diese Methode bietet eine sehr bequeme Möglichkeit, um die Wirkung von Medikamenten auf die neuroendokrine Tumorzellen zu untersuchen. Es könnte auch uns helfen, die menschliche neuroendokrinen Tumor Sphäroide für die Krebstherapie.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

28.5K Aufrufe.  Raymond and Beverly Sackler Foundation. Wir präsentieren eine einfache Agarose-Overlay-Plattform, um 3D-mehrzellige Sphäroide mit neuroendokrinen Krebszellen wachsen. Diese Methode bietet eine sehr bequeme Möglichkeit, um die Wirkung von Medikamenten auf die neuroendokrine Tumorzellen zu untersuchen. Es könnte auch uns helfen, die menschliche neuroendokrinen Tumor Sphäroide für die Krebstherapie.

Serie: Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Forschung

Medizin

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Einrichtung eines Menschen Multiple Myeloma Xenograftmodell im Huhn, das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese Studieren

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable risks for normal tissue injury and the hazards of physical tumor miss. A first-of-its-kind SBRT platform achieves high-precision ablative radiation treatment through a combination of versatile real-time imaging solutions and sophisticated tumor tracking capabilities. It uses dual-diagnostic kV x-ray units for stereoscopic open-loop feedback of cancer target intrafraction movement occurring as a consequence of respiratory motions and heartbeat. Image-guided feedback drives a gimbaled radiation accelerator (maximum 15 x 15 cm field size) capable of real-time &#177;4 cm pan-and-tilt action. Robot-driven &#177;60&#176; pivots of an integrated &#177;185&#176; rotational gantry allow for coplanar and non-coplanar accelerator beam set-up angles, ultimately permitting unique treatment degrees of freedom. State-of-the-art software aids real-time six dimensional positioning, ensuring irradiation of cancer targets with sub-millimeter accuracy (0.4 mm at isocenter). Use of these features enables treating physicians to steer radiation dose to cancer tumor targets while simultaneously reducing radiation dose to normal tissues. By adding respiration correlated computed tomography (CT) and 2-[18F] fluoro-2-deoxy-&#7429;-glucose (18F-FDG) positron emission tomography (PET) images into the planning system for enhanced tumor target contouring, the likelihood of physical tumor miss becomes substantially less1. In this article, we describe new radiation plans for the treatment of moving lung tumors.

Stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) involves the precise delivery of high-dose radiation to cancer tumor targets. A novel SBRT platform offers a first-of-its-kind gimbaled radiation accelerator mounted within a pivoting O-ring gantry capable of dynamic image-guided tumor tracking. Here, we describe dynamic tumor tracking for lung targets.

Dynamische Lungentumor Tracking für stereotaktische Strahlentherapie Körper Ablative

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...