Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es das vollständige Verfahren zur Herstellung von Tröpfchen aus dem Lipidfilm über die Lipidlösung bis hin zu Mikroblasen und dann zu Tröpfchen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Einfachheit der Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen. Allein durch Abkühlen und Verwirbeln können Tröpfchen ohne Druckbeaufdruckung hergestellt werden.
Eine visuelle Demonstration ist wichtig, da ein einfacher Test, um zu sehen, ob die Mikroblasen erfolgreich kondensiert wurden, darin besteht, die Änderung der Transluzenz visuell zu überprüfen. Kimoon Yoo, ein Masterstudent im Gang Zheng Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Entfernen Sie mit einem Decapper die Aluminiumdichtung auf der Serumdurchstechflasche und übertragen Sie einen Milliliter der Lipidlösung auf eine 1,85-Milliliter-Borosilikatglas-Probendurchstechflasche mit einem Phenol-Schraubverschluss, indem Sie die Lipidlösung die Innenwand hinunterfließen lassen, ohne Blasen zu erzeugen.
Mit der 1,85 Milliliter Probenfläschchen können Sie sich darauf vorbereiten, mit dem Gasaustauscher Dekafluorbutangas in den Kopfraum der Probenfläschchen zu fließen. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gastauscher ordnungsgemäß geschlossen und die Pumpe ausgeschaltet ist. Öffnen Sie das Verteilerventil und entfernen Sie vorsichtig die entsprechende Nadel aus dem Verteiler.
Öffnen Sie Druckventil A und Druckventil B und drehen Sie das Gasflaschenventil ca. 1/16 bis 1/8 gegen den Uhrzeigersinn, um es teilweise zu öffnen. Öffnen Sie das T-Griffventil und entkappen Sie die Probenfläschchen mit der Lipidlösung. Legen Sie die Verteilernadel über die Flüssigkeitsluftschnittstelle der Durchstechflasche, drehen Sie das Luftreglerventil langsam im Uhrzeigersinn, bis sich die Luftreglernadel leicht aus ihrer Ruheposition bewegt, und lassen Sie das Perfluorkohlenstoffgas 30 Sekunden lang sanft in den Kopfraum der Durchstechflasche fließen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.
Stellen Sie bei Bedarf das Luftreglerventil ein. Nach 30 Sekunden die Probenfläschchen sorgfältig und schnell aufbewahrt, ohne die Durchstechflasche zu sehr zu bewegen. Sowohl das Gasflaschenventil, das T-Griffventil, das Luftreglerventil, das Druckventil A, das Druckventil B und das Verteilerventil.
Ummanteln Sie die Nadel vorsichtig, beschriften Sie dann die Probenfläschchen und versiegeln Sie den Hals mit Wachsfolie im Uhrzeigersinn. Lagern Sie die Probenfläschchen im Dunkeln und bei vier Grad Celsius für mindestens 10 Minuten oder bis zu 24 Stunden. Legen Sie etwa 100 Gramm Trockeneis in einen isolierten Behälter und legen Sie normales Eis in einen anderen isolierten Behälter.
Holen Sie sich eine zuvor vorbereitete Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche auf 1,5-Zoll-20-Gauge-Nadeln, eine Ein-Milliliter-Kunststoffspritze, einen 200-Milliliter-Behälter, eine Metallzange und ein Thermometer. Legen Sie die Probendurchstechflasche mit der Lipidlösung in das mechanische Rührwerk und rühren Sie 45 Sekunden lang. Es sollte eine Veränderung der Farbe und Transluzenz geben.
Stellen Sie nach dem mechanischen Rühren die Probendurchstechflasche rechts vor Licht abgeschirmt auf und starten Sie einen 15-minütigen Countdown, um die Durchstechflasche abzukühlen und die Mikroblasen auszuwählen. Wenn der Countdown 10 Minuten erreicht hat, füllen Sie einen Behälter mit etwa 200 Millilitern Isopropanol und kühlen Sie ihn mit einer Metallzange auf minus 20 Grad Celsius mit Trockeneis ab. Nachdem die Mikroblasen 15 Minuten lang ausgewählt wurden, suchen Sie in der Beispielfläschchen nach der ausgewählten Partition.
Halten Sie die Probendurchstechflasche rechts oben, entkappen Sie die Probendurchstechflasche vorsichtig und ziehen Sie etwa 0,7 Milliliter der unteren Trennwand mit einer 1,5 Zoll 20-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Kunststoffspritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass keine der oberen Trennwände zurückgezogen ist, und bewegen Sie die Spritze nicht, um Lufteinschlüsse zu entfernen. Wenn Sie auf den Mittelkreis des Gummistopfens zielen, führen Sie eine andere 20-Gauge-Nadel in eine Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche ein, während Sie die Nadel in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche halten, um sie zu entlüften, und führen Sie dann die Nadel mit den ausgewählten Mikroblasen ein.
Übertragen Sie langsam die Größe der ausgewählten Mikroblasen. Lassen Sie die Flüssigkeit vorsichtig die Innenwand der Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche hinuntergleiten. Sobald die gesamte ausgewählte Mikroblasenlösung übertragen wurde, entfernen Sie die Nadel mit der Spritze, aber lassen Sie die Entlüftungsnadel drin, um den Unterdruck zu lindern.
Fügen Sie dem Isopropanolbad kleine Mengen Trockeneis oder Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu, um sicherzustellen, dass die Badtemperatur zwischen minus 15 und minus 17 Grad Celsius liegt. Mit der 20-Gauge-Entlüftungsnadel, die in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche eingeführt wurde, legen Sie die Serumfläschchen und das Isopropanolbad, wobei die Mikroblase unter dem Niveau des Isopropanols gehalten wird, aber der Fläschchenhals darüber und intermittierend die Serumfläschchen für zwei Minuten verwirbelt, um die Mikroblasen zu kondensieren. Schwenken Sie die Serumfläschchen nicht kontinuierlich im Isopropanol und lassen Sie die Lösung nicht einfrieren.
Etwa fünf Sekunden schwenken und die Serumfläschchen aus dem Isopropanol heben. Überprüfen Sie die Eiskeimbildung und setzen Sie dann das Wirbeln in Isopropanol fort. Wenn sich Eisbildung abnäht, schwenken Sie die Serumfläschchen in der Luft, bis sie sich auflöst.
Nach der zweiminütigen Kondensation die Serumfläschchen aus dem Isopropanolbad entfernen und die Entlüftungsnadel entfernen. Die Mikroblasen sollten zu Tröpfchen kondensiert sein, wie die Änderung der Transluzenz zeigt. Wischen Sie die Serumdurchstechflasche ab, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf normales Eis in einen dunklen isolierten Behälter, bis sie einsatzbereit ist.
Ungeöffnete Tröpfchen mit intakter Aluminiumdichtung sollten bis zu sechs Stunden stabil sein, solange das geschmolzene Eis bei Bedarf ausgetauscht wird. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, entfernen Sie die Aluminiumdichtung mit dem Decapper. Nach der Verwendung dieses Protokolls wurden vorkondensierte, größengewählte Mikroblasen und nachkondensierte Tröpfchen auf einem Coulter-Zähler mit einer 10-Mikron-Öffnung dimensioniert.
Die Größendaten für die 30%ige Pyrolipidformulierung werden gezeigt. Die Statistiken, die auf den Größendaten basieren, werden hier angezeigt. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass mit zunehmendem Pyrolipidgehalt die Konzentration abnahm und der mittlere Durchmesser zunahm.
Die repräsentativen Absorptionsmittelmessungen der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe werden gezeigt. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen, die sich in unterschiedlichen Peaks widerspiegeln. Repräsentative Blütenstandsmessungen der vorkondensierten Mikroblasen-, postkondensierten Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid werden hier gezeigt und zeigen unterschiedliche Fluoreszenzpeaks für intakte Proben in der gestörten Form.
Es werden repräsentative Ultraschallbilder der 30%igen Pyro-Lipid-Tröpfchen-Probe gezeigt, die bei unterschiedlichen Drücken abgebildet wurden. Bei niedrigen Drücken wurde nur ein Hintergrundsignal von Luftblasen beobachtet, die von der Agarsynthese festhielten. Bei einer etwas höheren Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt, was durch das Auftreten von hellen Flecken demonstriert wird.
Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kondensationstemperatur hier für diese spezifische Tröpfchenschalenformulierung optimiert ist. Unterschiedliche Schalenformulierungen können eine andere Temperatur erfordern.
