Dieses Protokoll beschreibt das chemische Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Telomeren zu induzieren. Es kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Loci zu induzieren, und eignet sich zur Untersuchung der Bildung und Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten. Diese Methode bietet eine zeitliche Auflösung, die für die Bildgebung lebender Zellen erforderlich ist, und hält die Phasentrennung in der Zellpopulation für biochemische Assays aufrecht.
Zunächst werden Dimerisatoren in DMSO bei 10 Millimolar gelöst und in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff bei minus 80 Grad Celsius zur Langzeitlagerung gelagert. Verdünnen Sie ein Aliquot von 10 Millimolar-Dimerizer im Bildmedium auf eine Stammkonzentration von 10 Mikromolaren und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Wenn sie gebrauchsfertig sind, verdünnen Sie Dimerisatoren auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 Nanomolar in Wachstumsmedium oder Bildgebungsmedium.
Säen Sie 10 bis die fünften Zellen in kreisförmigen Deckgläsern mit 12 Millimeter Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in einer Sechs-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie dann die Zellen mit den Halo-GFP-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDFR-SIM mutierten Plasmiden und warten Sie 24 bis 48 Stunden, bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren. Die verdünnten 100 nanomolaren Dimerizer in die Zellen geben und bei 37 Grad Celsius vier bis fünf Stunden lang inkubieren.
Nach der Inkubation die Zellen in PBS-Lösung mit 4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, um die Zellen zu permeabilisieren. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Waschbezug rutscht zweimal mit 50 Mikrolitern TBS-Tx und einmal mit 50 Mikrolitern Antikörperverdünnungspuffer.
Inkubieren Sie jeden Deckzettel mit 50 Mikrolitern primärer Anti-PML-, Anti-SUMO-1- oder Anti-SUMO-2- und 3-Antikörper bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer über Nacht. Der Waschdeckel rutscht dreimal mit einem Antikörperverdünnungspuffer, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen, und inkubiert die Zellen dann mit sekundären Antikörpern für eine Stunde in einer dunklen Box bei Raumtemperatur. Nach dem Färben rutscht der Waschdeckel dreimal mit TBS-Tx.
Beschriften Sie dias, indem Sie zwei Mikroliter von einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzufügen, dann die Cover-Slips umdrehen und auf den DAPI-Drop legen. Saugen Sie zusätzliche Flüssigkeit vom Rand des Deckelschlupfes ab. Versiegeln Sie den Schlitten mit Nagellack, lassen Sie ihn trocknen und spülen Sie die Oberseite des Deckzettels mit Wasser ab.
Legen Sie die Dias bis zur Bildgebung in den Gefrierschrank. Samen Sie 10 bis die fünften Zellen auf 12 Millimeter kreisförmigen Deckgläsern, die mit Poly-D-Lysin in einer Sechs-Well-Platte beschichtet sind, und transfizieren Sie sie mit Halo-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM mutierten Plasmiden. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie sie viermal mit PBS.
Für IF-FISH färben Sie die Zellen mit primären und sekundären Antikörpern und fixieren Sie sie mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie sie dann viermal mit PBS und dehydrieren Sie die Deckzettel in einer Ethanol-Serie. Inkubieren Sie die Deckzettel mit der 488 Telomer C-PNA-Sonde in fünf Mikrolitern Hybridisierungslösung bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten und inkubieren Sie die Abdeckungsrutsche über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Bezug dreimal mit Waschpuffer für zwei Minuten pro Waschgang bei Raumtemperatur und montieren Sie ihn mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI in Montagemedien für die Bildgebung.
Für die Live-Bildgebung montieren Sie die Abdeckungsrutsche in magnetischen Kammern auf einer beheizten Bühne in einer Umweltkammer und halten die Zellen in einem Milliliter Bildmedium ohne Phenolrot. Stellen Sie das Mikroskop und die Umgebungskontrollvorrichtung wie im Textmanuskript beschrieben auf. Lokalisieren Sie Zellen mit einem hellen GFP-Signal auf den Telomeren und einem diffusiven mCherry-Signal im Zytosol.
Finden Sie etwa 20 Zellen, merken Sie sich jede Position mit den XYZ-Informationen und richten Sie Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung ein. Verwenden Sie einen Abstand von 0,5 Mikrometern für insgesamt acht Mikrometer in Z und ein Fünf-Minuten-Zeitintervall für zwei bis vier Stunden für GFP- und mCherry-Kanäle. Verwenden Sie 30% von 594 Nanometern und 50% von 488 Nanometern Leistungsintensität, mit Belichtungszeiten von 200 Millisekunden und einer Kameraverstärkung von 300.
Beginnen Sie mit der Bildgebung und nehmen Sie eine Zeitschleife als Vordimerisierung. Dann die Bildgebung pausieren, 0,5 Milliliter Bildgebungsmedien mit 15 Mikrolitern 10 Mikromolardimerizer in die Bildgebungskammer geben, achten Sie darauf, die Bühne nicht zu berühren, und setzen Sie die Bildgebung fort. Wenn Sie bereit sind, die Dimerisierung umzukehren, pausieren Sie die Bildgebung und fügen Sie der Bildgebungskammer 0,5 Milliliter Bildmedien mit zwei Mikrolitern 100 Millimolar-TMP hinzu.
Fahren Sie mit der Bildgebung der Zellen für ein bis zwei Stunden fort. Verwenden Sie für die feste Bildgebung das gleiche Mikroskop-Setup wie bei der Live-Bildgebung, jedoch ohne Die Bühnenheizung. Suchen Sie etwa 30 bis 50 Zellen mit dem roten Signal, um für transfizierte Zellen auszuwählen.
Erfassen Sie Bilder mit einem Abstand von 0,3 Mikrometern für insgesamt acht Mikrometer in Z. Verwenden Sie 80% von 647 Nanometern, 80% von 561 Nanometern und 70% von 488 Nanometern Leistungsintensität mit Belichtungszeiten von 600 Millisekunden und einer Kameraverstärkung von 300. Die telomere Lokalisation von SUMO wurde mit Telomer-DNA-FISH und SUMO-Protein-Immunfluoreszenz identifiziert. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO-1 und SUMO-2 und 3 im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung, was darauf hindeutet, dass sim-dimerisierung induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Interaktionen abhängt.
Ein Zeitrafferfilm von TRF-1 und SIM nach Dimerisierung wird hier gezeigt. SIM wurde erfolgreich für Telomere rekrutiert, und sowohl SIM- als auch TRF-1-Herde wurden größer und heller, wie für die Bildung und das Wachstum von Flüssigkeitströpfchen vorhergesagt. Darüber hinaus wurde eine Fusion von TRF-1-Herden beobachtet, die zu einer Telomerclusterung führte, wie die reduzierte Telomerzahl und die erhöhte Telomerintensität im Laufe der Zeit zeigen.
Im Gegensatz dazu wurde die SIM-Mutante nach der Dimerisierung zu Telomeren rekrutiert, induzierte jedoch keine Tröpfchenbildung oder Telomerclustering, was darauf hindeutet, dass Phasentrennung und Telomerclustering durch SUMO-SIM-Interaktionen angetrieben werden. Die Umkehrung der Phasentrennung und des Telomerclusterings wurde nach Zugabe von überschüssigem freiem TMP beobachtet. Die Telomerzahl nahm zu und die Telomerintensität nahm im Laufe der Zeit ab.
Repräsentative Bilder von APBs, die durch Telomer-DNA FISH und PML-Protein IF identifiziert wurden, sind hier dargestellt. Zellen mit rekrutierter SIM haben mehr APBs als Zellen mit rekrutierter SIM-Mutante, was darauf hindeutet, dass Dimerisierungs-induzierte Kondensate tatsächlich APBs sind. Setzen Sie bei der Durchführung dieses Protokolls keine lichtempfindlichen Dimerizer Licht aus.
Arbeiten Sie in einem dunklen Raum mit einer Lampe, die rotes Licht ausstrahlt und wickeln Sie Zellen während der Inkubation mit Aluminiumfolie. Nach diesem Verfahren kann mit der Proximity-Markierung eine umfassende Liste der Komponenten im induzierten Kondensat erstellt werden. Live-Imaging kann verwendet werden, um die Dynamik von Komponenten im Kondensat zu verfolgen.
Diese Methoden können helfen, die Rolle der Steuerung der Kondensatzusammensetzung zu bestimmen.
