Dieses Protokoll ist eine einfache Methode zur Verringerung der Polydispersität von verdampfbaren Tröpfchen mit niedrigem Siedepunkt für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen. Diese Technik kondensiert vorgeformte Gasmikrobläschen und filtert die resultierenden Flüssigkeitströpfchen nach Größe auf eine Weise, die kontrollierbar, skalierbar und relativ kostengünstig ist. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Lipid-Mikrobläschen mit unterschiedlichem Schalen- und Gasmaterial angewendet werden, wobei verschiedene Filter verwendet werden, um die endgültige Tröpfchengröße zu kontrollieren.
Darrah Merillat, ein Undergraduate-Forscher aus Dr. Sirsis Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Schalten Sie den Netzschalter für den Ultraschallgerät ein und stellen Sie die Amplitude mit dem Mikrospitzenaufsatz auf das maximal zulässige Maß ein, und stellen Sie sicher, dass die Beschallungszeit auf 10 Sekunden eingestellt ist. Legen Sie die warme hydratisierte Lipidlösung mit der Mikrospitze direkt unter der Oberfläche in das Schallgehäuse.
Befestigen Sie eine geeignete Schlauchlänge am Hals der Durchstechflasche, um das Gas aus dem DFB-Tankauslass in die warme Lipidlösung im Gehäuse zu leiten. Öffnen Sie das Tankventil langsam, bis das Gas über die Lipidlösung fließt und leichte Wellen auf der Oberfläche der Flüssigkeit verursacht. Wenn der Gasfluss zu hoch ist, läuft die Lösung während der Bildung von Mikroblasen über.
Starten Sie den Ultraschallgerät und lassen Sie ihn 10 Sekunden lang kontinuierlich laufen, um Mikroblasen zu erzeugen. Nachdem die Beschallung beendet ist, schließen Sie sofort das DFB-Tankventil. Schließen Sie die Mikrobläschenlösung schnell ab und tauchen Sie die Durchstechflasche in ein Eisbad, um die Probe unter 55 Grad Celsius abzukühlen.
Verwenden Sie einen 200-Nanometer-Keramikfilter, um den Hochdruckextruder gemäß der Bedienungsanleitung zusammenzubauen, und legen Sie ihn in die Mitte eines wasserdichten Behälters, so dass das Probenauslassrohr nicht an die Seite gedrückt oder gekräuselt wird. Koppeln Sie den Extruder mit dem vom Hersteller gelieferten Adapter an den Stickstoffgastank. Legen Sie das Ende des Auslassrohrs in eine Szintillationsflasche, um die extrudierte Probe zu sammeln, und befestigen Sie das Röhrchen mit Klebeband am Behälter, um in der Durchstechflasche zu bleiben.
Öffnen und schließen Sie das Entriegelungsventil, um sicherzustellen, dass kein Druck im Extruder vorhanden ist. Entfernen Sie den Kammerdeckel. Und geben Sie fünf Milliliter PBS in die Extruderkammer.
Setzen Sie den Deckel wieder ein und stellen Sie sicher, dass er wieder sicher einrastet. Öffnen Sie den Stickstoffgastank, so dass das Manometer 250 PSI anzeigt, und stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil in der geschlossenen Position befindet. Schließen Sie den Gastank und öffnen Sie das Einlassventil der Extruderkammer, wodurch die PBS-Lösung durch das System gedrückt und das Probenauslassrohr in die Szintillationsflasche herausgeschoben wird.
Wenn nur Gas aus dem Schlauch austritt, öffnen Sie das Freigabeventil und lassen Sie den Druck auf Null PSI fallen. Entfernen Sie dann die Szintillationsfläschchen. Öffnen und schließen Sie das Ablassventil, um sicherzustellen, dass sich kein Druck im Extruder befindet, und legen Sie eine neue Szintillationsflasche am Ende des Auslassrohrs.
Füllen Sie einen Stahlbehälter mit 2-Methylbutan und fügen Sie Trockeneis hinzu, um die Temperatur auf minus 18 Grad Celsius zu senken. Geben Sie die Mikrobläschenlösung in das gekühlte 2-Methylbutan und tauchen Sie die Probe für zwei Minuten unter. Bewegen Sie die Szintillationsfläschchen während der zwei Minuten, um die Blasen vorsichtig zu mischen.
Fügen Sie nach Bedarf Trockeneis hinzu, um die Temperatur zwischen minus 15 und minus 18 Grad Celsius zu halten. Nach zwei Minuten entfernen Sie die Mikrobläschen aus dem gekühlten 2-Methylbutan. Schwenken Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Mikrobläschen zu mischen, und übertragen Sie die Blasen in eine gekühlte 10-Milliliter-Spritze.
Entfernen Sie den Deckel der Extruderkammer und geben Sie die Mikrobläschenlösung in die Kammer, indem Sie den Kolben langsam auf die Spritze drücken. Setzen Sie die Extruderkappe wieder ein, und stellen Sie sicher, dass sie sicher einrastet. Stellen Sie sicher, dass sich das Druckregelventil und das Ablassventil des Extruders in der geschlossenen Position befinden.
Öffnen Sie den Stickstoffgastank, bis das Manometer 250 PSI anzeigt. Schließen Sie den Gastank und drehen Sie das Druckregelventil in die geöffnete Position. Wenn die Lösung das Szintillationsfläschchen am Ausgangsschlauch gefüllt hat und nur Gas aus dem Rohr austritt, öffnen Sie langsam das Druckentlastungsventil und lassen Sie den Druck auf Null PSI fallen.
10 Milliliter der extrudierten Tröpfchenlösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die extrudierte Probe bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und die spontan verdampften Tröpfchen, die an der Oberseite der Lösung erscheinen.
Resuspendierung des Pellets, das DFP-Nanotröpfchen in 10 Milliliter PBS mit 20% Glycerin und 20% Propylenglykol enthält. Die Größenverteilung von kondensierten Blasenlösungen mit und ohne Extrusion zeigt, dass die kondensierte einzige Probe eine viel breitere Verteilung in der Nähe von 400 Nanometern hat, während die extrudierte Probe eine engere Verteilung bei 200 Nanometern hat. Eine abstimmbare Widerstandspulssensoranalyse, die zur Analyse von Phasenverschiebungströpfchen verwendet wird, wenn sie durch Zentrifugation gewaschen wurden, um überschüssige Liposomen zu entfernen, zeigt, dass die Tröpfchengrößen in der Nähe von 200 Nanometern liegen.
Die Mikroskopiedaten der Nanotröpfchenverdampfung beim Erhitzen zeigen, dass einige spontan verdampfte Mikroblasen vor dem Erhitzen im Sichtfeld sichtbar sind und eine größere Anzahl von Gasmikroblasen nach dem Erhitzen beobachtet wird. Hier werden die Mikroskopiebilder von Nanotröpfchen gezeigt, die direkt ohne Vorkühlung in den Extruder eingeführt, bei null Grad Celsius und bei minus 18 Grad Celsius kondensiert werden. Repräsentative Bilder von kondensierten Octafluorpropantröpfchen vor und nach der Verdampfung zeigen auch eine größere Anzahl von Gasmikrobläschen nach dem Erhitzen, ähnlich den DFB-Tröpfchen.
Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, dass die Tröpfchenausbeute während der Kondensation stark von der Temperatur und dem Druck abhängt und leichte Schwankungen die Ergebnisse beeinflussen. Nach der Erzeugung verdampfbarer Tröpfchen können sie verwendet werden, um die In-vivo-Bildgebung und die Arzneimittelabgabe mittels Ultraschall sowie andere In-vivo- und Ex-vivo-Anwendungen zu optimieren. Nach der Entwicklung dieser Technik wurden die Auswirkungen der Nanotröpfchengröße und des Gaskerngehalts auf die In-vivo-Verdampfungsschwellen durch leichte Modifikationen dieses Protokolls untersucht.
