Dieses Protokoll zeigt die Produktion von transgenem Fall Armyworm unter Verwendung eines PiggyBac-basierten Transformationssystems. Wir hoffen, dass diese Methoden der Verbesserung der Transformation zugute kommen werden, nicht nur beim Herbst-Heerwurm, sondern auch bei Lepidoptera-Insekten. Die hier beschriebene Methode macht die Keimbahntransformation von Lepidoptera-Schadinsekten effizient.
Das Verfahren wird von Dr. Xien Chen, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie, indem Sie 12 männliche Puppen und 12 weibliche Puppen in eine Box legen. Geben Sie eine 10% ige Saccharoselösung in die Box zur Fütterung von Erwachsenen.
Decken Sie die Box mit einem Papiertuch ab. Setzen Sie die Erwachsenen am zweiten Tag nach der Eklosion über Nacht intensivem Licht aus. Bringen Sie die Erwachsenen am dritten Tag nach der Eklosion an einen dunklen Ort.
Sammeln Sie die Embryonen innerhalb von zwei Stunden nach der Überposition. Fügen Sie Wassertropfen auf das Stück des Papiertuchs mit frischen Eiern hinzu, die in einer Petrischale auf Eis aufbewahrt werden. Übertragen Sie die Eier vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf einen Glasträger und richten Sie sie nacheinander auf einem Glasobjektträger aus.
Halten Sie die Glasobjektträger mit den Eiern vor der Mikroinjektion auf Eis ausgerichtet. Injizieren Sie eine Mischung aus 200 Nanogramm pro Mikroliter PiggyBac-basiertem EGFP-exprimierendem Plasmid, 200 Nanogramm pro Mikroliter hyperaktiver PiggyBac-Transposase-mRNA und sterilem destilliertem Wasser in die Eier unter Verwendung des Kompensationsdrucks des automatisierten Mikroinjektors. Halten Sie die injizierten Eier bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius, 60 plus oder minus 10% relativer Luftfeuchtigkeit bis zum Schlüpfen.
Füttern Sie die geschlüpften Larven künstlich und übertragen Sie jede Larve im frühen Quark- und Sternstadium in eine kleine Tasse. Sammeln Sie die Puppen und legen Sie ungefähr 150 weibliche und 150 männliche Puppen in einen Käfig. Hängen Sie mehrere 30 Zentimeter mal 15 Zentimeter große Papiertücher in den Käfig, um die Eier zu sammeln.
Sammeln Sie die Papiertücher täglich mit Eiern und bewahren Sie die Eier bis zum Schlüpfen unter geeigneten Bedingungen auf. Halten Sie die neugeborenen Larven fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um sie zu immobilisieren, und übertragen Sie sie dann auf eine eiskalte Platte. Screenen Sie die immobilisierten Neugeborenenlarven unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop.
Wählen Sie die EGFP-positiven Neugeborenen aus, heben Sie sie in etwa zwei Wochen bei 27 plus oder minus einem Grad Celsius in das Puppenstadium. Die in vitro synthetisierte hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA wurde mit einem 1%igen Agarose-Gel nachgewiesen. Die PDS-injizierten Embryonen zeigten kein EGFP-Signal, während das EGFP-exprimierende Plasmid und die hyperaktive PiggyBac-Transposase-mRNA-injizierten Embryonen EGP-Fluoreszenz zeigten, was darauf hindeutet, dass die PiggyBac-Konstruktion erfolgreich war.
Die G1-Larven, die aus Eiern gewonnen wurden, die aus einer Selbstkreuzung von G0-Erwachsenen resultierten, zeigten ein starkes EGFP-Signal. Ein Fragment, das den Promotor und das EGFP-Fragment enthielt, wurde erfolgreich unter Verwendung der genomischen DNA, die aus den EGFP-positiven Larven isoliert wurde, als Vorlage amplifiziert. Das gleiche Fragment wurde jedoch nicht nachgewiesen, als genomische DNA aus den Wildtyplarven als Vorlage isoliert wurde.
Die Eier für die Mikroinjektion sollten so frisch wie möglich sein und müssen vor der Mikroinjektion immer auf Eis aufbewahrt werden, um ihre Entwicklung zu verlangsamen. Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, Fragen in der funktionellen Genomik von Schädlingsinsekten zu beantworten und genetische Bekämpfungsmethoden für diesen globalen Schädling zu entwickeln.
